喬占國，汪 芳，吳嬌嬌，張春妮，張澤寧，宛 濤，郝 好，劉 龍

(1.陜西省榆林市林業(yè)科學(xué)研究所，陜西 榆林 719000；2.榆林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 榆林 719000；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

蒿屬(Artemisia)是菊科春黃菊族(Anthemideae Cass.)的一個(gè)大屬[1]。全國均有分布，多數(shù)集中于我國“三北”地區(qū)及西南各省區(qū)，約有186種[2]。其花粉數(shù)量多、個(gè)體小，風(fēng)媒傳粉，部分種的花粉含有致敏原[3]，是重要的氣傳致敏花粉[4]。國內(nèi)外研究其花粉形態(tài)的學(xué)者很多[5-13]，主要致力于蒿屬種間分類的花粉形態(tài)觀察描述，對同一種植物2種花粉形態(tài)的微觀數(shù)量特征差異顯著性分析十分匱乏。有學(xué)者初步觀察到黑沙蒿(Artemisiaordosica)花粉存在2種形態(tài)[1]，但未深入分析其微形態(tài)特征及數(shù)量特征的差異顯著性。宛濤等[14]、郝好[15]對冷蒿(Artemisiafrigida)和紫花冷蒿(Artemisiafrigidavir.atropurpurea)的花粉形態(tài)進(jìn)行了研究，蔡萍等[16]對烏丹蒿(Artemisiawudanica)花粉形態(tài)二型性也進(jìn)行了專項(xiàng)觀察，但黑沙蒿花粉形態(tài)二型性的深入系統(tǒng)研究成果尚未見報(bào)道?；ǚ鄱托?pollen dimorphism)是正常和異常2種不同形態(tài)的花粉同時(shí)共存于同一花藥中的現(xiàn)象，經(jīng)誘導(dǎo)，異?；ǚ哿？梢孕纬苫ǚ叟?，被稱為胚性花粉或E花粉(embryonic pollen)[17-18]。花粉二型性對植物種間鑒別、屬種分類及與環(huán)境的相互依存關(guān)系等密切相關(guān)。黑沙蒿是毛烏素沙地最主要的建群種之一，具有非常重要的生態(tài)價(jià)值，但其致敏性引發(fā)的過敏性鼻炎、哮喘，已嚴(yán)重影響了人們的生產(chǎn)生活，因此很有必要進(jìn)一步客觀準(zhǔn)確地闡述陜北沙區(qū)黑沙蒿花粉的形態(tài)特征，為探索其致敏性、蒿屬間系統(tǒng)分類、生物多樣性研究等提供孢粉學(xué)依據(jù)。本研究采用掃描電鏡(SEM)顯微技術(shù)，對其花粉形態(tài)及二型性特征進(jìn)行了詳細(xì)觀察及表型特征分析研究。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于毛烏素沙地南緣的榆林市小紀(jì)汗、昌汗界、補(bǔ)浪河和巴拉素等地。樣地年均氣溫8.3 ℃～10.1 ℃，極端高溫42.1 ℃(7月)、極端低溫-31.8 ℃(1月)，≥10 ℃的積溫2 800～3 400 ℃。年降水量350～503 mm，集中于6-9月，年蒸發(fā)量2 000～2 500 mm。該區(qū)屬溫帶半干旱大陸性季風(fēng)氣候，冬季盛行偏北風(fēng)，夏季盛行偏南風(fēng)，風(fēng)大沙多；光照充足，晝夜溫差大，無霜期短[19]。地表主要是第四紀(jì)松散堆積物，土壤為風(fēng)沙土；地帶性植被為荒漠草原，其間有大面積人工植被分布，以黑沙蒿為建群種的沙生植被最發(fā)達(dá)[20]。

1.2 材料

供試材料為20世紀(jì)80年代在榆林市周邊飛播的次生黑沙蒿群落。在陜西省榆林市小紀(jì)汗、昌汗界、補(bǔ)浪河和巴拉素4個(gè)村，選擇基礎(chǔ)環(huán)境基本相同，固定和半固定沙丘均勻分布，黑沙蒿長勢基本一致的4塊樣地，于2020年8月2-4日，分別隨機(jī)采集3個(gè)植株標(biāo)本及花粉樣品。黑沙蒿7月上旬為始花期，7月中旬到8月上旬為盛花期和散粉高峰期。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 2020年8月2-4日，榆林沙區(qū)黑沙蒿盛花期和散粉高峰期，在小紀(jì)汗、昌汗界、補(bǔ)浪河和巴拉素4個(gè)樣地隨機(jī)采集黑沙蒿植株及花粉并編號，將植株標(biāo)本夾在標(biāo)本夾中[21]?；ǚ蹣悠酚脼V紙包裝，放入干燥容器，儲藏于2～5 ℃?zhèn)溆肹22-25]。

1.3.2 樣品處理 將采集的黑沙蒿植株移交植物分類專家鑒定，再把鑒定正確無誤的植株制成蠟葉標(biāo)本，然后將編號對應(yīng)的花粉樣品進(jìn)一步干燥、除雜等處理。將處理好的花粉樣品分為2份：一份用王伏雄改進(jìn)的醋酸酐分解法[13]酸解處理后，制成光鏡切片；另一份包在紗布中輕輕抖動，均勻地撒在置于載物臺的雙面膠紙上，經(jīng)IB-5型離子濺射儀噴金鍍膜，制成掃描電鏡樣品[14]。

1.3.3 顯微觀察 將待檢黑沙蒿花粉樣品置于日立S-530掃描電子顯微鏡下，調(diào)整放大倍數(shù)，多角度觀察其群體和個(gè)體的形態(tài)特征，以及極面、赤道面、萌發(fā)器官和外壁紋飾等，詳細(xì)記錄其典型特征及關(guān)鍵參數(shù)并拍照[26]。將待檢光鏡切片置于OLYMPUSB X41光學(xué)顯微鏡下，轉(zhuǎn)換觀察角度，調(diào)整放大倍數(shù)，仔細(xì)觀察萌發(fā)器官并確定其形態(tài)和數(shù)量特征。對照光學(xué)和電子顯微鏡的觀測結(jié)果和掃描照片，逐個(gè)準(zhǔn)確測量花粉粒的極軸、赤道軸長度及大小，詳細(xì)記錄其大小、形態(tài)、萌發(fā)器官和外壁紋飾等細(xì)微結(jié)構(gòu)特征[27]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析 嚴(yán)格按照孢粉學(xué)要求隨機(jī)選擇30?；ǚ圻M(jìn)行測量，花粉粒的所有數(shù)據(jù)均來源于其平均值[17]，最后用Excel2019和SPSS 22.0軟件處理。而長球形花粉粒與圓球形花粉粒在樣本中的占比來自于對2 510粒花粉的觀察統(tǒng)計(jì)。其中花粉粒的極軸平均長度用P表示，赤道軸植株平均長度用E表示，單位為μm。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑沙蒿花粉形態(tài)總體特征

經(jīng)觀察，黑沙蒿花粉粒具有蒿屬植物花粉的共性特征，其總體形態(tài)特征為：花粉粒外表輪廓波浪形，形狀呈球形、近球形，極面觀形狀為三裂圓形；大小15.8～24.9 μm，屬小型花粉粒；花粉萌發(fā)器官3孔溝，溝較長，邊緣或光滑整齊或粗糙，可達(dá)兩極，兩極鈍圓，溝間較寬；花粉粒外壁表面紋飾為退化小刺與顆粒狀紋飾的組合，刺基部膨大，分布較均勻，刺長約1.88 μm；刺間較均勻地分布有小顆粒狀紋飾。黑沙蒿花粉除具有蒿屬花粉的共性特征而外，還具有二型性特征，長球形和圓球形2種形態(tài)不同的花粉粒同時(shí)存在于同一花藥中，2種花粉粒都屬于小型單粒花粉，即便成熟后都能單獨(dú)以單粒形式呈現(xiàn)。除此而外，黑沙蒿花粉粒在大小、赤道面觀、萌發(fā)器官和表面紋飾等方面也有其自身特點(diǎn)(表1)。

表1 黑沙蒿花粉形態(tài)總體特征

2.2 黑沙蒿長球形花粉的形態(tài)特征

長球形花粉粒外表輪廓為波浪形；赤道軸長16.93(15.81～17.32)μm，赤道面觀長橢圓形；極軸長23.43(20.10～24.91)μm，極面觀三裂圓形；P/E=1.38。萌發(fā)器官3孔溝，溝深而細(xì)長，邊緣較整齊光滑，可達(dá)兩極，內(nèi)孔深陷；溝間稍窄，極區(qū)面積較小。花粉粒表面為退化小刺與顆粒狀紋飾的組合，刺基部較小，頂部漸尖，較短，分布較稀疏均勻；刺間顆粒較小，稀疏均勻(圖1)。

注：A：長球形花粉粒赤道面; B:長球形花粉粒極面; C：長球形花粉粒表面紋飾[16,21]。

2.3 黑沙蒿圓球形花粉的形態(tài)特征

圓球形花粉粒外表輪廓為小波浪形，赤道軸長17.10(15.99～18.01)μm，赤道面觀圓球形；極軸長17.56(16.11～18.43)μm，極面觀三裂圓形；P/E=1.03。萌發(fā)器官3孔溝，溝較淺較短，溝緣較粗糙，內(nèi)孔外突；溝間較寬，極區(qū)面積較大?；ǚ哿１砻鏋橥嘶〈膛c顆粒狀紋飾的組合，刺基部膨大，較短，頂部漸尖，分布較均勻密集；刺間顆粒較大，排列較密(圖2)。

注：A：圓球形花粉粒赤道面; B：圓球形花粉粒極面;C：圓球形花粉粒表面紋飾[16,21]。

2.4 黑沙蒿2種花粉粒形態(tài)特征比較

黑沙蒿2種形態(tài)的花粉?？傮w主要特征較一致，但其形狀、大小、P/E值、赤道面觀存在差異。長球形花粉粒赤道面觀為橢圓形，圓球形赤道面觀為圓球形；長球形花粉的極軸長23.43 μm，赤道軸長16.93 μm，P/E=1.38；圓球形花粉的極軸和赤道軸長度接近，為17.10～17.56 μm，P/E=1.03。顯然，2種花粉粒的極軸、赤道軸長度及其比值P/E不同，導(dǎo)致了其赤道面形狀的差異，長球形花粉粒赤道面觀橢圓形，圓球形赤道面觀圓球形。與此同時(shí)，2種花粉粒的外壁表面紋飾和萌發(fā)器官微性狀也不相同。2種花粉的萌發(fā)器官都具3孔溝，但長球形花粉的溝深而細(xì)長，邊緣較整齊光滑，可達(dá)兩極，內(nèi)孔深陷，溝間稍窄，極區(qū)面積較?。粓A球形花粉的溝較淺較短，溝緣較粗糙，內(nèi)孔外突，溝間較寬，極區(qū)面積較大；外壁表面紋飾兩者都為退化小刺與顆粒狀紋飾的組合，但刺的分布、基部大小及刺間顆粒的大小和排列等有所差異，長球形花粉刺基部膨大，分布較稀疏均勻；刺間顆粒較小，稀疏均勻；而圓球形花粉刺基部較小，分布較均勻密集，刺間顆粒較大，排列較密。

黑沙蒿長球形花粉粒極軸與赤道軸長度差異顯著(P<0.05)，赤道面觀為橢圓形；圓球形花粉粒極軸與赤道軸長度相近，差異不顯著(P>0.05)，赤道面觀為圓形；兩者的P/E差異顯著。由此表明，黑沙蒿花粉具有長球形和圓球形2種形態(tài)，兩者差異明顯，具有非常明顯的二型性特征。

通過3次光鏡觀察的樣品共計(jì)2 510粒，其中長球形花粉1 610粒，占比64.1%；圓球形花粉900粒，占比35.9%。樣本中長球形花粉粒所占比例顯著高于圓球形花粉粒，說明黑沙蒿花粉中以長球形花粉粒為主(表2)。

表2 黑沙蒿2種花粉形態(tài)特征比較

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

黑沙蒿花粉形態(tài)特征與蒿屬植物花粉形態(tài)總體特征一致，均為單粒小型花粉，具3孔溝，表面紋飾特征屬于第Ⅰ類，即退化小刺與顆粒狀紋飾的組合。

黑沙蒿花粉粒具明顯的二型性特征，長球形花粉和圓球形2種形態(tài)花粉同時(shí)存在同一花藥中。長球形花粉粒外表輪廓為波浪形；極軸長23.43(20.10～24.91)μm，赤道軸長16.93(15.81～17.32)μm，極軸與赤道軸長度差異顯著(P<0.05)，P/E=1.38；圓球形花粉粒外表輪廓為小波浪形；極軸長17.56(16.11～18.43)μm，赤道軸長17.10(15.99～18.01)μm，極軸與赤道軸長度差異不顯著(P>0.05)，P/E=1.03。2種花粉粒的P/E差異顯著(P<0.05)。長球形花粉粒在樣本中占比為64.1%，圓球形花粉粒占比為35.9%。

黑沙蒿花粉粒形態(tài)特征的特點(diǎn)首先受自身遺傳基礎(chǔ)控制，其次是其對長期適應(yīng)生存環(huán)境的響應(yīng)，是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的產(chǎn)物。同時(shí)也反映出了進(jìn)化物種的特點(diǎn)。

3.2 討論

3.1.1 黑沙蒿花粉粒的形態(tài)特征 蒿屬花粉總體形態(tài)特征為：小型單?；ǚ?，形狀呈圓球形或長球形，極面觀三裂圓形或三裂片圓形，赤道面觀圓形或橢圓形；花粉具3孔溝，孔明顯，溝中間寬兩頭窄，深淺長短不一，邊緣整齊或不整齊；表面紋飾為刺與顆粒、顆粒與微刺或網(wǎng)胞與刺等的復(fù)合紋飾[15]，一般用紋飾類型Ⅰ-Ⅵ來表示[10]。黑沙蒿花粉粒符合蒿屬植物花粉總體特征，為小型單粒花粉，萌發(fā)器官3孔溝，花粉粒表面紋飾屬于退化小刺與顆粒狀紋飾的組合，可歸第Ⅰ類。但同一花藥中有長球形和圓球形2種形態(tài)花粉粒，長球形花粉粒極軸長23.43 μm，赤道軸長16.93 μm，P/E=1.38，極軸與赤道軸差異明顯，赤道面觀為橢圓形；而圓球形花粉粒極軸長17.56 μm，赤道軸長17.10 μm，P/E=1.03，極軸與赤道軸相近，赤道面觀為圓球形。長球形花粉粒輪廓為波浪形，萌發(fā)器官3孔溝，溝深而細(xì)長，邊緣較整齊光滑，可達(dá)兩極，內(nèi)孔深陷，溝間稍窄，極區(qū)面積較??；而圓球形花粉粒輪廓為小波浪形，萌發(fā)器官3孔溝，溝較淺較短，溝緣較粗糙，內(nèi)孔外突，溝間較寬，極區(qū)面積較大。長球形花粉粒表面為退化小刺與顆粒狀紋飾的組合，刺基部膨大，較短，頂部漸尖，分布較稀疏均勻；刺間顆粒較小，稀疏均勻；圓球形花粉粒表面也為退化小刺與顆粒狀紋飾的組合，但刺基部較小，頂部漸尖，較短，分布較均勻密集，刺間顆粒較大，排列較密。

3.1.2 黑沙蒿花粉粒二型性的特征及比例 許多孢粉學(xué)研究資料認(rèn)為，花粉形態(tài)是植物總體性狀的重要組成部分，它既有科、屬的共同特征，也有種的特異性[7,9]。我國學(xué)者曾觀察到植物花粉二型現(xiàn)象，宛濤等觀察到紫花冷蒿和冷蒿的花粉二型性比例分別為45%～64.5%和20%[14-15]；蔡萍等[16]觀察到烏丹蒿花粉二型性出現(xiàn)的比例為60.1%。李懋學(xué)[28]發(fā)現(xiàn)芍藥花粉也有二型性，正?；ǚ酆彤惓；ǚ鬯急壤謩e為75.8%和24.2%。本試驗(yàn)觀察到，圓球形和長球形2種花粉形態(tài)同時(shí)存在于黑沙蒿同一花藥中，具有花粉二型性特征，對兩者的極軸和赤道軸長度及其比值P/E進(jìn)行T檢驗(yàn)，差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，花粉二型性特征非常明顯。其長球形花粉粒在樣本中所占比例高達(dá)64.1%，而圓球形花粉粒比例為35.9%。

3.1.3 黑沙蒿花粉粒二型性的成因 花粉形態(tài)是植物總體性狀中較重要的部分，是在長期進(jìn)化過程中不斷演化和發(fā)展形成的[23,29]，花粉粒的性狀特征也符合遺傳穩(wěn)定性和多樣性的規(guī)律，主要是受其遺傳基礎(chǔ)控制，也受其長期生存環(huán)境影響[30]。宛濤等認(rèn)為冷蒿正種與變種花粉形態(tài)差異與體內(nèi)遺傳基礎(chǔ)受到長期生存環(huán)境影響有關(guān)[14]；N.Suoderlond[31]則認(rèn)為花粉二型性的產(chǎn)生與花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂末期Ⅱ時(shí)發(fā)生了軸向改變有關(guān)；G.埃爾特曼[32]推測與雄蕊中花絲的長短有關(guān)，且花粉不止有二型，還應(yīng)有三型或更多；而梁漢興[33]推測五指蓮二型性花粉粒產(chǎn)生的原因是小孢子在第1次有絲分裂時(shí)少數(shù)紡錘體進(jìn)行了平周分裂。在所有植物總體性狀中，花粉形態(tài)特征是較為穩(wěn)定的進(jìn)化性狀，相對比較保守，外界環(huán)境條件對其影響較小[14,34]，但也符合不同生態(tài)條件對植物花粉形態(tài)構(gòu)建的塑造規(guī)律[35]。黑沙蒿2種形態(tài)花粉粒的極軸(P)和赤道軸(E)長度以及P/E值差異明顯，導(dǎo)致2種花粉粒的大小、赤道面形狀有所不同。特別是其表面紋飾退化為小刺狀，與菊科以蟲媒為主的其他屬的長刺明顯不同[4]，這與其長期適應(yīng)干旱少雨、風(fēng)大沙多的荒漠惡劣環(huán)境及風(fēng)媒傳粉有關(guān)，同時(shí)也是其自身遺傳性狀及長期適應(yīng)生存環(huán)境共同影響的特征。

3.1.4 黑沙蒿花粉粒的進(jìn)化現(xiàn)狀 一般情況下，花粉粒形狀是由單溝的舟形、縱長形演化為具溝的球形、扁球形，然后演化為扁球形、圓球形，最后演化為長球形；花粉粒表面紋飾是由外壁表面光滑演化為外壁表面具有條紋狀、網(wǎng)狀，最后演化為花粉表面疣狀、刺狀[36-37]。被子植物花粉和裸子植物花粉一般有單槽型和三溝型，花粉從單槽型演化到三溝型的進(jìn)化趨勢，通常情況下是不可逆轉(zhuǎn)的[36,38]。根據(jù)以上觀點(diǎn)，綜合黑沙蒿花粉具3孔溝、表面刺狀-顆粒狀復(fù)合紋飾等形態(tài)特征分析，黑沙蒿應(yīng)屬于較為進(jìn)化的物種。