李紅俊 王靜 范欽 劉蜻蜻 陳海燕 洪文娟 余卓銳 成家茂

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展的中間環(huán)節(jié)，隨著肝纖維化程度加重，可引起全身血流動(dòng)力學(xué)的變化，嚴(yán)重時(shí)可引起肝腎綜合征，致死率較高，因此早期發(fā)現(xiàn)肝纖維化對(duì)腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變，以及臨床監(jiān)測(cè)腎損傷的程度、預(yù)防肝腎綜合征的發(fā)生有著重要參考價(jià)值［1］。腎損傷在肌酐（Cr）升高之前僅表現(xiàn)腎血流量和腎小球?yàn)V過(guò)率降低，研究［2］表明，腎皮質(zhì)血流減少是發(fā)生腎損傷的關(guān)鍵因素。常規(guī)影像學(xué)技術(shù)CT、MRI及PET診斷早期腎損傷并不敏感，且所得參數(shù)差異也較大。超聲造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）可提高超聲對(duì)低速血流的探測(cè)效果，實(shí)時(shí)、定量評(píng)估腎組織內(nèi)血流灌注信息［3］。鐵皮石斛作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，能夠改善肝纖維化［4］，本課題組前期研究［5］發(fā)現(xiàn)高劑量鐵皮石斛（7.5 g/kg）較低劑量（1.5 g/kg）能夠顯著降低肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)，抑制活化人肝星狀細(xì)胞系-LX2的增殖，促進(jìn)其凋亡進(jìn)而改善肝纖維化，使全身及腎臟血供得以改善，具有腎保護(hù)作用。然而，鐵皮石斛對(duì)肝纖維化后腎損傷時(shí)微循環(huán)灌注的影響鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CEUS定量評(píng)估高劑量鐵皮石斛對(duì)肝纖維化后大鼠腎損傷時(shí)微循環(huán)灌注的影響，旨在為其改善腎損傷作用提供可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取同批次健康SPF級(jí)SD雄性大鼠24只，6～8周齡，體質(zhì)量240～265 g，平均（250±20）g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2021-030。所有大鼠均在大理大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，普通飲食、飲水，定期消毒。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：20210115J0382）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物模型建立及分組：將24只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、鐵皮石斛干預(yù)組，每組各8只；其中模型組、鐵皮石斛干預(yù)組大鼠分別于皮下注射肝臟毒性藥物四氯化碳橄欖油溶液5 ml/kg，每周2次，連續(xù)注射5周，建立肝纖維化大鼠模型。參照本課題組前期研究［5］方法，采用高劑量鐵皮石斛鮮榨汁（7.5 g/kg，鐵皮石斛鮮株由云南立卡生物科技有限公司提供）對(duì)鐵皮石斛干預(yù)組予以每天早上9時(shí)開始灌胃1次，正常組及模型組則同步予以等量生理鹽水灌胃；均連續(xù)灌胃4周。每日灌胃后及處死前分別觀察各組大鼠飲食、飲水、精神狀態(tài)、毛發(fā)、大小便、活動(dòng)情況，以及體質(zhì)量變化等。

2.CEUS檢查：檢查前用10%水合氯醛溶液（0.35 ml/100 g）行腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于平板上，75%酒精全身消毒，剃除腹部毛發(fā)。使用東芝Aplio 500彩色多普勒超聲診斷儀，L5-14線陣探頭，頻率5.0～7.5 MHz；機(jī)械指數(shù)0.08，聚焦范圍置于中間位置。探頭置于大鼠腎臟（本研究選取右腎為觀察對(duì)象）最大冠狀截面，CDFI定位于腎動(dòng)脈主干，常規(guī)超聲觀察腎臟長(zhǎng)徑、前后徑、腎皮質(zhì)厚度及血流情況；然后切換至CEUS模式，經(jīng)尾靜脈團(tuán)注SonoVue（意大利Bracco公司），劑量0.1 ml/kg，隨即注射0.2 ml生理鹽水沖管，同時(shí)以57幀/s速度采集從造影劑注入至注射后3 min的動(dòng)態(tài)圖像，實(shí)時(shí)觀察從腎門腎動(dòng)脈主干到腎皮質(zhì)的造影劑增強(qiáng)過(guò)程。存儲(chǔ)動(dòng)態(tài)圖像，應(yīng)用儀器自帶分析軟件進(jìn)行脫機(jī)分析。盡可能取同一深度和位置、直徑為0.4 mm的圓形取樣框貼近腎包膜下最外層皮質(zhì)為感興趣區(qū)，繪制腎皮質(zhì)血流灌注時(shí)間-強(qiáng)度曲線，定量分析達(dá)峰時(shí)間（TTP）、峰值強(qiáng)度（PSI）、曲線上升斜率（A）和曲線下面積（AUC）。所有參數(shù)均重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

3.腎功能檢測(cè)及病理學(xué)檢查：分別于造模第5周末及鐵皮石斛灌胃后第4周末處死大鼠，提前1 d收集24 h尿液。于空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行充分麻醉，常規(guī)消毒后開腹，暴露心臟及腹主動(dòng)脈，剪斷腹主動(dòng)脈并取血5 ml，送昆明塞維爾檢驗(yàn)公司檢測(cè)尿Cr、血Cr和血尿素氮（BUN），并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）代替腎小球?yàn)V過(guò)率，公式為［6］：Ccr（ml·min-1·kg-1）=尿Cr（mg/dl）×24 h尿量（ml）/血Cr（mg/dl）×2440（min）×體質(zhì)量（kg）。隨后將灌注針管從腹主動(dòng)脈刺入，剪破心腔，500 ml生理鹽水緩慢滴灌，直至心臟流出液呈無(wú)色。待肝臟、腎臟發(fā)白后，剪取右腎和部分肝葉，置于10%福爾馬林溶液中固定48 h以上，常規(guī)脫水、石蠟包埋，行肝、腎組織切片，厚3 μm。HE及Masson染色后置于光鏡下觀察各組大鼠肝組織病理改變，并評(píng)估高劑量鐵皮石斛干預(yù)對(duì)大鼠腎組織損傷的影響。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組大鼠一般情況及平均體質(zhì)量變化比較

正常組全部大鼠均存活，模型組和鐵皮石斛干預(yù)組由于造影劑過(guò)量或造影觀察時(shí)間過(guò)久各死亡1只。正常組大鼠飲食、精神、活動(dòng)均正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)較快；模型組大鼠攝食量及自主行為減少，精神明顯變差，毛發(fā)發(fā)黃、脫落，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，后期消瘦明顯；鐵皮石斛干預(yù)組較模型組各項(xiàng)癥狀均有所減輕，體質(zhì)量增加。各組大鼠體質(zhì)量變化整體呈上升趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量隨時(shí)間變化曲線圖

二、各組大鼠腎臟常規(guī)超聲及CEUS檢查結(jié)果比較

1.常規(guī)超聲檢查結(jié)果：各組大鼠腎臟均呈蠶豆形，腎包膜光滑、清晰；CDFI示見(jiàn)各組大鼠腎動(dòng)脈管腔內(nèi)血流信號(hào)充盈良好，色彩明亮度肉眼未見(jiàn)明顯差異。各組大鼠腎臟長(zhǎng)徑、前后徑和腎皮質(zhì)厚度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2和表1。

表1 各組大鼠腎臟大小比較（±s） mm

表1 各組大鼠腎臟大小比較（±s） mm

組別正常組模型組鐵皮石斛干預(yù)組F值P值長(zhǎng)徑18.363±0.427 18.050±0.994 18.200±0.475 0.420＞0.05前后徑8.625±0.962 8.575±0.306 8.600±0.227 0.014＞0.05腎皮質(zhì)厚度2.388±0.181 2.188±0.295 2.275±0.104 1.851＞0.05

圖2 各組大鼠腎臟常規(guī)超聲圖像

2.CEUS檢查結(jié)果：經(jīng)大鼠尾靜脈團(tuán)注SonoVue后，各組均按腎動(dòng)脈主干、段動(dòng)脈、葉間動(dòng)脈、弓形動(dòng)脈、腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、腎竇的順序依次增強(qiáng)，模型組及鐵皮石斛干預(yù)組腎臟造影的增強(qiáng)速度慢于正常組，正常組增強(qiáng)區(qū)域造影劑分布細(xì)密、均勻，模型組較正常組稀疏、粗糙，鐵皮石斛干預(yù)組次之；待造影劑達(dá)峰值后，則按腎竇、腎髓質(zhì)、腎皮質(zhì)的順序依次廓清。與正常組比較，模型組和鐵皮石斛干預(yù)組大鼠腎皮質(zhì)TTP延長(zhǎng)，PSI和A均降低，AUC增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，鐵皮石斛干預(yù)組大鼠腎皮質(zhì)TTP縮短，PSI和A均增高，AUC減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖3。

圖3 各組大鼠腎臟CEUS圖

表2 各組大鼠CEUS腎皮質(zhì)血流灌注參數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠CEUS腎皮質(zhì)血流灌注參數(shù)比較（±s）

與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。TTP：達(dá)峰時(shí)間；PSI：峰值強(qiáng)度；A：曲線上升斜率；AUC：曲線下面積

組別正常組模型組鐵皮石斛干預(yù)組F值P值A(chǔ)UC（dB·s）1748.663±127.832 2436.937±298.097★2064.837±121.928★△23.725＜0.05 TTP（s）1.363±0.302 2.163±0.239★1.850±0.230★△16.476＜0.05 PSI（dB）89.138±8.042 73.163±5.823★79.788±3.296★△14.126＜0.05 A（dB/s）96.988±8.448 78.688±6.401★88.425±5.963★△13.605＜0.05

三、各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

與正常組比較，模型組和鐵皮石斛干預(yù)組大鼠血Cr、BUN水平升高，Ccr水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，鐵皮石斛干預(yù)組大鼠血Cr、BUN水平下降，Ccr水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）

與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。Cr：肌酐；BUN：尿素氮；Ccr：內(nèi)生肌酐清除率

組別正常組模型組鐵皮石斛干預(yù)組F值P值Ccr（ml·min-1·kg-1）4.46±0.37 2.54±0.42★3.79±0.22★△62.02＜0.05血Cr（μmol/L）30.14±4.44 64.68±8.00★56.65±9.40★△9.99＜0.05血BUN（mmoL/L）6.24±1.60 13.82±5.13★10.11±2.38★△45.56＜0.05

四、各組大鼠肝、腎組織病理學(xué)變化比較

光鏡下，大鼠肝組織HE及Masson染色結(jié)果顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索以中央靜脈為中心呈輻射狀緊密排列，匯管區(qū)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化；模型組肝索排列紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量脂肪空泡，匯管區(qū)明顯擴(kuò)展，并見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、大量纖維間隔和假小葉形成；鐵皮石斛干預(yù)組較模型組肝纖維化呈不同程度改善，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，纖維間隔和假小葉分布減少。見(jiàn)圖4。腎組織HE染色結(jié)果顯示，各組大鼠腎小球、腎小管和間質(zhì)區(qū)均未見(jiàn)明顯異常病理改變。見(jiàn)圖5。

圖4 各組大鼠肝組織病理圖（A～C為HE染色，×200；D～F為Masson染色，×200）

圖5 各組大鼠腎組織病理圖示腎小球、腎小管和間質(zhì)區(qū)均未見(jiàn)明顯異常（HE染色，×200）

討 論

肝纖維化是肝細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)引起的一個(gè)可逆性修復(fù)反應(yīng)，肝持續(xù)出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積和纖維結(jié)締組織增生，并以肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、纖維間隔及假小葉形成為主要病理特征，進(jìn)而影響肝臟的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組體質(zhì)量較模型組和鐵皮石斛干預(yù)組增長(zhǎng)較快，鐵皮石斛干預(yù)組體質(zhì)量較模型組增長(zhǎng)，但較正常組大鼠低。表明肝纖維化導(dǎo)致大鼠營(yíng)養(yǎng)吸收障礙，繼而出現(xiàn)體質(zhì)量下降，符合肝纖維化后病理生理改變。當(dāng)肝纖維化進(jìn)入晚期（Ⅳ期）即肝硬化階段，全身及腎臟血流動(dòng)力學(xué)會(huì)隨之發(fā)生改變，加之炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)菌移位，易并發(fā)腎功能性損傷［2］；此外，肝纖維化后肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞可產(chǎn)生大量的局部血管擴(kuò)張劑，如一氧化氮、一氧化碳、內(nèi)源性大麻素等，其可作用于局部?jī)?nèi)臟循環(huán)從而引起動(dòng)脈血管舒張，進(jìn)一步加重了腎臟微循環(huán)灌注的下降，極易誘發(fā)肝腎綜合征。肝腎綜合征作為肝纖維化后腎損傷較為嚴(yán)重的一種并發(fā)癥，是一組繼發(fā)于有效血容量下降、內(nèi)源性血管活性物質(zhì)失衡和腎血流量減少，并以腎功能不全為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，腎臟常無(wú)明顯病理改變［7］。目前預(yù)測(cè)肝纖維化后腎功能損傷和肝腎綜合征仍缺乏有效的評(píng)價(jià)方法，主要依靠臨床排除。Cr、BUN、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白和胱抑素C是臨床監(jiān)測(cè)腎功能最常見(jiàn)的標(biāo)志物，但早期檢測(cè)的敏感性相對(duì)較低［8］。正常情況下腎皮質(zhì)的血供豐富，約占總腎血流量的90%，腎臟的血流灌注情況直接影響腎功能，多數(shù)腎功能損傷或腎衰竭均與腎皮質(zhì)血流灌注下降有關(guān)［9］。常規(guī)超聲是臨床評(píng)價(jià)腎臟形態(tài)及其血流動(dòng)力學(xué)最簡(jiǎn)便的方法，但其僅能在腎損傷的終末期才顯示腎臟形態(tài)學(xué)的改變，彩色多普勒超聲也僅能反映腎臟主要大血管主干的血流信息，無(wú)法評(píng)估腎皮質(zhì)微循環(huán)灌注狀況。本實(shí)驗(yàn)常規(guī)超聲檢查顯示，各組大鼠腎臟長(zhǎng)徑、前后徑及腎皮質(zhì)厚度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明常規(guī)超聲難以早期評(píng)估肝纖維化后腎損傷情況。

CEUS是在常規(guī)超聲基礎(chǔ)上通過(guò)觀察造影劑的顯影過(guò)程反映血流灌注情況，并繪制造影劑在血管內(nèi)分布曲線，即時(shí)間-強(qiáng)度曲線，可定量評(píng)估腎血流動(dòng)力學(xué)狀況，能為腎損傷后微循環(huán)灌注提供重要的功能學(xué)信息［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和鐵皮石斛干預(yù)組大鼠腎皮質(zhì)TTP延長(zhǎng)，PSI和A均降低，AUC增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，鐵皮石斛干預(yù)組大鼠腎皮質(zhì)TTP縮短，PSI和A均增高，AUC減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與斯妍娜等［11］應(yīng)用CEUS評(píng)價(jià)右美托咪定對(duì)兔腎缺血/再灌注損傷時(shí)微循環(huán)灌注的變化趨勢(shì)基本一致，故鐵皮石斛對(duì)肝纖維化大鼠腎損傷的作用機(jī)制可能與右美托咪定相似，主要通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)使腎臟中、小動(dòng)脈舒張及減輕腎血管內(nèi)血流瘀滯的雙重作用，從而發(fā)揮改善腎微循環(huán)灌注的效果。Zhao和Han［12］研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛可以降低糖尿病腎病大鼠白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等炎性因子的RNA表達(dá)水平，且呈劑量依賴性，抑制炎癥反應(yīng)，恢復(fù)腎臟功能。同時(shí)，因鐵皮石斛對(duì)肝纖維化的改善作用，使全身循環(huán)不足的情況得以緩解，腎臟的血流灌注增加。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CEUS進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，由于腎臟微循環(huán)灌注的改善，使SonoVue微泡進(jìn)入腎血管床的時(shí)間和廓清時(shí)間均縮短，從而表現(xiàn)為PSI和A均增高，AUC減少。另外，模型組和鐵皮石斛干預(yù)組大鼠肝組織HE及Masson染色均出現(xiàn)肝纖維化病理特征，且腎功能指標(biāo)血Cr和BUN水平均升高，Ccr水平均下降，與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示腎功能受損；但腎組織病理學(xué)檢查顯示腎小球、腎小管和腎間質(zhì)均無(wú)明顯異常，表明肝纖維化引起了非器質(zhì)性慢性腎損傷，鐵皮石斛干預(yù)組大鼠腎功能指標(biāo)較模型組有所改善，證明鐵皮石斛能夠改善大鼠腎微循環(huán)灌注。

綜上所述，應(yīng)用CEUS可實(shí)時(shí)、定量評(píng)估鐵皮石斛對(duì)肝纖維化模型大鼠腎損傷時(shí)微循環(huán)灌注的影響；且高劑量鐵皮石斛能改善肝纖維化大鼠腎損傷時(shí)的微循環(huán)灌注情況。但本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本較少，所采用的評(píng)價(jià)方法在有效性、穩(wěn)定性和可靠性等方面尚待進(jìn)一步研究。