占扎君,鄭 瓊,彭 媛,裘飛君,陳 艷

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.浙江新光藥業(yè)股份有限公司,浙江 紹興 312000)

生脈飲由張元素的《醫(yī)學(xué)啟源》中記載的生脈散演變而來[1]。傳統(tǒng)的生脈飲由人參、麥冬和五味子組成[2-4],而由黨參、麥冬和五味子組成的黨參方生脈飲是由傳統(tǒng)的生脈飲演變而來,兩者均具有益氣滋陰、養(yǎng)心復(fù)脈的功效[5-7]。相較于人參,黨參的性較平,較緩和,適用于輕癥和慢性疾病,而人參方生脈飲則多用于重癥或者急癥[8-9],兩者的臨床應(yīng)用歷史已經(jīng)十分悠久,備受醫(yī)者青睞[10]。筆者研究使用的是黨參方生脈飲,側(cè)重于生津養(yǎng)血,補中益氣[11]。黃芪是豆科植物的中藥材,被譽為是補氣血的良藥[12-13],臨床上常用于脾肺氣虛等癥狀。在黨參方生脈飲中加入黃芪,即為黃芪生脈飲復(fù)方,該復(fù)方可增強補虛和補氣的作用,主要用于氣陰兩虧,心悸氣短,自汗和病毒性心肌炎[14-17]等癥狀。目前,大量的研究報道都集中在人參方生脈飲,對于黨參方生脈飲的報道較少,且多集中于成分的測定以及質(zhì)量控制[18]。

以黨參方生脈飲為研究對象,在生脈飲基礎(chǔ)上加入黃芪制成黃芪生脈飲及黃芪生脈顆粒,通過構(gòu)建小鼠氣虛癥、陰虛癥模型,研究黃芪生脈飲及黃芪生脈顆粒對于氣虛和陰虛癥狀的作用,對其作用機制進行探討,為其進一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

黃芪生脈飲及黃芪生脈顆粒,批號:20170705,20180704,購自新光藥業(yè)股份有限公司;六味地黃丸(4 g/kg),批號:190643,購自上海普康藥業(yè)有限公司;肝糖原ELISA試劑盒,批號:20191107、肌糖原ELISA試劑盒,批號:20191108、cAMP ELISA試劑盒,批號:20191112、cGMP ELISA試劑盒,批號:20191113、印度墨汁,批號:20191115,均購自上海源葉生物科技有限公司;PBS緩沖液,購自北京索萊寶科技有限公司;甲狀腺素片(80 mg/kg),批號:20190603、碳酸鈉,購自上海長城藥業(yè)有限公司。

1.2 儀 器

721分光光度計,購自上海光譜儀器有限公司;BS224S電子分析天平,購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;5810R高速冷凍離心機,購自貝克曼庫爾特公司。

1.3 動 物

雌性ICR小鼠168只,20～24 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,寄養(yǎng)于浙江工業(yè)大學(xué)實驗動物中心動物房,動物質(zhì)量許可證號:SCXK(浙)2019-0002。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥

氣虛小鼠模型:中醫(yī)理論中素有疲勞耗氣傷氣的說法,過度疲勞則會耗氣,長此以往則會有氣虛的表現(xiàn),采用小鼠負重游泳至力竭法建立氣虛小鼠模型,該法操作方便且造模時間短,是適用于研究氣虛病癥的一種較好的造模方法[19]。小鼠隨機分為正常組、模型對照組、模型給藥組—黃芪生脈飲、顆粒高劑量組(373 mg/kg)、黃芪生脈飲、顆粒中劑量組(280 mg/kg)、陽性對照組(六味地黃丸4 g/kg),每組12只。實驗過程中,連續(xù)給予基礎(chǔ)進食量。除正常組小鼠,所有組小鼠游泳的水溫均控制在25 ℃,盛于塑料桶中。小鼠游泳時,不可將尾部撐在池底休息。除正常組外,各組小鼠10%尾部負荷體質(zhì)量游泳致力竭,1次/d;其他的實驗期間內(nèi),各組小鼠均按照常規(guī)來進行,每次小鼠游泳至力竭時才結(jié)束其在水中的強迫運動。筆者實驗參照MCARDLE推薦的力竭判斷標準,即游泳至最后下沉,經(jīng)10 s后仍沒有返回水面為力竭[20-21]。

陰虛小組模型:以甲狀腺素灌胃建立小鼠陰虛模型,其造模思路主要是模擬“甲狀腺功能亢進”時出現(xiàn)的怕熱,體溫升高,基礎(chǔ)代謝率提高等類陰虛的現(xiàn)象,以甲狀腺激素造模,小鼠的死亡率低,操作方便且造模時間短,是深入研究陰虛病癥的一種較好的造模方法[22]。將小鼠隨機分為7組,每組12只,分別為正常組、模型對照組(甲狀腺80 mg/kg)、模型給藥組—黃芪生脈飲及黃芪生脈顆粒高劑量組(373 mg/kg)、黃芪生脈飲及黃芪生脈顆粒低劑量組(186.5 mg/kg)、陽性對照組(六味地黃丸4 g/kg)。在實驗過程中,上午除正常對照組外均灌胃給藥甲狀腺素80 mg/kg,正常對照組給予等體積的生理鹽水,下午各組分別灌胃各組藥物,連續(xù)灌胃14 d。其余實驗期間,各組小鼠均按常規(guī)進行,每次小鼠游泳至力竭時才結(jié)束其在水中的強迫運動。

2.2 氣虛小鼠模型組

2.2.1 小鼠體質(zhì)量測定

所有小鼠至實驗第1,4,8,12,15天時,于藥品灌胃后30 min稱質(zhì)量。

2.2.2 負重游泳耐力時間

所有小鼠實驗于第1,4,8,12,15天稱重后,尾部以體重10%負荷,在恒溫水槽中進行力竭游泳實驗,單獨游泳致力竭并記錄其時間,并分析最后一天各組小鼠游泳時間。

2.2.3 血漿中cAMP和cGMP的濃度測定

實驗第15天,末次給藥30 min后,隨機選取每組中6只小鼠,并對其摘眼球取血,加入0.9 ml PBS緩沖液,置于冰上勻漿,ELISA試劑盒檢測血漿中cAMP和cGMP的濃度,并求出其cAMP/cGMP的比值水平。

2.2.4 糖原的質(zhì)量分數(shù)測定

實驗第15天,末次給藥30 min后,隨機選取每組中6只小鼠,肝糖原:取小鼠0.1 g肝臟加入0.9 mL的PBS緩沖液置于冰上勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清采用酶聯(lián)免疫法測定肝糖原的質(zhì)量分數(shù);肌糖原:取股四頭肌0.1 g,加入0.9 mL的PBS緩沖液置于冰上勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清,采用酶聯(lián)免疫法測定肌糖原的質(zhì)量分數(shù)。

2.2.5 吞噬指數(shù)以及碳粒廓清指數(shù)的計算

實驗第15天,末次給藥30 min后,對各組剩余小鼠尾靜脈注射20%印度墨汁0.1 mL/10 g,在注射2 min和10 min后,分別從眼眶后靜脈叢取血20 μL,溶于2 mL 0.1%的Na2CO3溶液中搖勻,置于721型分光光度計,波長600 nm處比色,測定光密度OD,最后將小鼠脫臼處死,分別稱取肝、脾質(zhì)量。

碳粒廓清指數(shù)K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)

(1)

式中:K為碳粒廓清指數(shù);OD1和OD2分別為注射2 min,10 min后的光密度,t1和t2分別為2 min,10 min。

吞噬指數(shù)α=k1/3×體質(zhì)量/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)

(2)

式中:α為吞噬指數(shù);k為碳粒廓清指數(shù)。

2.3 陰虛小鼠模型組

2.3.1 小鼠體重測定

所有小鼠至實驗第1,4,8,12,15天時,于藥品灌胃后30 min稱質(zhì)量。

2.3.2 負重游泳耐力時間測定

所有小鼠最后一次給藥1 h后進行負重力竭游泳,在小鼠尾根部負荷其體質(zhì)量10%的鉛條作為重物,放入水深35 cm,水溫(20±5) ℃的水桶中,小鼠的尾巴不能接觸桶底,每次2 只,力竭判斷標準為小鼠沉入水底超過9 s不能回到水面,為力竭游泳時間,及時將小鼠撈起,吹干毛發(fā)。

2.3.3 肌肉中cAMP和cGMP的濃度測定

實驗第15天,末次給藥30 min后,隨機選取每組中6只小鼠,稱取0.1 g小鼠大腿處肌肉,加入0.9 mL的PBS緩沖液,置于冰上勻漿,在ELISA試劑盒檢測肌肉內(nèi)cAMP和cGMP的濃度,并求出其cAMP/cGMP的比值水平。

2.3.4 糖原的質(zhì)量分數(shù)測定

實驗第15天,末次給藥30 min后,隨機選取每組中6只小鼠,稱取0.1 g小鼠大腿處肌肉,加入0.9 mL的PBS緩沖液,置于冰上勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清采用酶聯(lián)免疫法測定肌糖原的質(zhì)量分數(shù)。稱取0.1 g小鼠肝臟,加入0.9 mL的PBS緩沖液,置于冰上勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清用ELISA試劑盒檢測肝糖原的質(zhì)量分數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 氣虛小鼠模型組

3.1.1 體重測定

相較于與正常組，造模后的模型組小鼠的體重明顯降低,具有顯著性差異(p<0.01),各給藥組與模型組相比小鼠的體重無顯著性差異,由此可以發(fā)現(xiàn)給藥黃芪生脈飲、顆粒不會對小鼠的體重造成影響,各組小鼠的體重變化情況如圖1所示。圖1中：##表示與正常組相比,p<0.01。

圖1 黃芪生脈飲、顆粒對小鼠體重的影響Fig.1 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on body weight of mice

3.1.2 負重游泳耐力時間測定

氣虛最直觀的表現(xiàn)就是疲勞和無力,運動耐力是反映機體疲勞最直接、最客觀的指標,而力竭游泳時間則是反映運動耐力的主要指標。各組小鼠的力竭游泳時間如圖2所示。與模型組相比,*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。

1—正常組;2—模型組;3—陽性組;4—黃芪生脈飲中劑量組;5—黃芪生脈顆粒中劑量組;6—黃芪生脈飲高劑量組;7—黃芪生脈顆粒高課題組。圖2 黃芪生脈飲、顆粒對小鼠運動能力的影響Fig.2 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on exercise ability of mice

由圖2可知:相較于正常組，造模后的模型組小鼠雖然單獨游泳致力竭的時間下降,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),陽性組與模型組相比,雖然給藥后游泳時間有所增加,但是差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。而不論是黃芪生脈飲還是黃芪生脈顆粒,與模型組相比,中劑量給藥以后,不僅游泳時間明顯增加,而且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),高劑量給藥后,游泳時間延長,具有顯著性差異(p<0.01)。結(jié)合力竭游泳時間是反應(yīng)運動耐力的主要指標,可以發(fā)現(xiàn)中、高劑量的黃芪生脈飲和顆粒不僅具有緩解疲勞的作用,而且可能有劑量依賴性。

3.1.3 血漿中cAMP和cGMP的濃度測定

cAMP和cGMP兩者呈拮抗性共同參與細胞反應(yīng)的調(diào)節(jié),在正常的情況下,cAMP和cGMP的水平呈相反的變化,且兩者的濃度要保持動態(tài)平衡,從而使機體保持平衡,測定cAMP和cGMP的濃度以及兩者的比值可以作為氣虛的一個客觀性指標。黃芪生脈飲、顆粒對氣虛小鼠血漿中cAMP和cGMP濃度的影響如表3所示。

表3 黃芪生脈飲、顆粒對氣虛小鼠血漿中cAMP和cGMP的影響Table 3 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on cAMP and cGMP in plasma of mice with qi deficiency

由表3可知:與正常組相比,造模后血漿中cAMP的濃度增加,cGMP的濃度減少,且具有顯著性差異(p<0.01),符合氣虛模型特點;與模型組相比,各給藥組給藥后,血漿中cAMP濃度均降低,其中高劑量給藥組的效果更加明顯(p<0.001),血漿中cGMP濃度均升高,高劑量給藥組的效果仍然更加明顯(p<0.01),說明中、高劑量的黃芪生脈飲、顆粒不僅可以改善小鼠的陰虛狀態(tài),而且可能呈劑量依賴性。

3.1.4 糖原的質(zhì)量分數(shù)測定

肌肉活動時所需要的能量主要來自于糖原,強度較大的運動之后,肌糖原的質(zhì)量分數(shù)會有所降低,體力的衰竭與肌糖原的衰竭幾乎是同時發(fā)生的,所以一般可以用糖原的質(zhì)量分數(shù)來間接說明疲勞程度,在肌糖原減少的同時,為了維持體內(nèi)血糖的水平,肝糖原的儲備量也會降低,因此可以將糖原的質(zhì)量分數(shù)作為評價指標之一。各組小鼠的糖原質(zhì)量分數(shù)變化情況如表4所示。

表4 黃芪生脈飲、顆粒對小鼠糖原質(zhì)量分數(shù)的影響

由表4可知:與正常組相比,肝糖原與肌糖原的質(zhì)量分數(shù)均無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05);與模型組相比,各給藥組給藥后,肝糖原質(zhì)量分數(shù)均升高,且具有顯著性差異(p<0.05),黃芪生脈飲、顆粒中劑量給藥組、陽性給藥組給藥后,肌糖原質(zhì)量分數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),黃芪生脈飲、顆粒高劑量給藥后,肌糖原質(zhì)量分數(shù)增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),說明中、高劑量的黃芪生脈飲、顆粒不僅可以增加肝糖原的儲備,而且可以提高肌糖原的質(zhì)量分數(shù)。

3.1.5 碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)

單核巨噬細胞系統(tǒng)(網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),Reticuloen-dothelialsystem,RES)是機體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,因其能迅速清除多種致病物質(zhì),故是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個最重要的系統(tǒng)。作為免疫細胞的一種,巨噬細胞具有多種免疫功能,參與免疫反應(yīng),在炎癥、腫瘤以及感染等很多疾病中都發(fā)揮了很重要的作用。在一定范圍內(nèi)體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系。黃芪生脈飲、顆粒對小鼠吞噬指數(shù)和碳粒廓清速度的影響如表5所示。

表5 黃芪生脈飲、顆粒對小鼠吞噬指數(shù)和碳粒 廓清速度的影響

由表5可知:與正常組相比,造模后模型組小鼠的吞噬指數(shù)和碳粒廓清指數(shù)明顯減低,有顯著性差異(p<0.01),符合氣虛模型的特點;與模型組相比,黃芪生脈飲、顆粒中劑量,黃芪生脈飲、顆粒高劑量及陽性組給藥后,小鼠吞噬指數(shù)升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),說明低、高計量的黃芪生脈飲、顆粒均可以提高吞噬細胞的吞噬能力,可以調(diào)節(jié)小鼠的非特異性免疫功能。針對碳粒廓清指數(shù),與模型組相比,各給藥組小鼠給藥后都顯著升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),進一步說明低、高劑量的黃芪生脈飲和顆粒均可以增強小鼠的非特異性免疫功能。

3.2 陰虛小鼠模型組

3.2.1 體質(zhì)量測定

小鼠體質(zhì)量的變化情況如圖3所示。圖3中:##表示與正常相比,p<0.01。由圖3可知:實驗剛開始時,與正常組相比,各組小鼠的體質(zhì)量明顯降低,有顯著性差異,符合陰虛證的一般狀態(tài)特征,并且各組小鼠體質(zhì)量總體呈上升趨勢,給藥組與模型組之間無明顯差異,說明甲狀腺素對小鼠體質(zhì)量不會造成影響,且高、低劑量給藥黃芪生脈飲、顆粒均可以使小鼠的體質(zhì)量恢復(fù)至正常水平。

圖3 黃芪生脈飲、顆粒對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.3 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on weight of mice

3.2.2 力竭游泳時間測定

各組小鼠負重力竭游泳時間的測定結(jié)果如圖4所示。圖4中:與正常組相比,##p<0.01,與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。由圖4可知:與正常組比較,模型組小鼠的負重力竭游泳時間顯著縮短,具有顯著性差異(p<0.01),符合陰虛證小鼠模型特征;黃芪生脈飲、顆粒低劑量、高劑量組以及陽性藥組小鼠負重游泳時間均長于模型組,與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,特別是黃芪生脈飲、顆粒高劑量組效果最佳(p<0.001),且給藥黃芪生脈飲與給藥黃芪生脈顆粒所測定的力竭游泳時間結(jié)果無顯著性差異,說明黃芪生脈飲、顆粒均能夠改善小鼠的陰虛癥狀;與陽性組比較,黃芪生脈飲、顆粒高劑量組小鼠的負重力竭游泳時間無顯著性差異。

圖4 黃芪生脈飲、顆粒對小鼠運動能力的影響Fig.4 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on exercise ability of mice

3.2.3 肌肉組織中cAMP和cGMP濃度的測定

cAMP和cGMP的拮抗性調(diào)節(jié)作用可以用中醫(yī)的“陰”和“陽”來概括[23],有研究表明:陰虛時,cAMP的濃度增加,cAMP與cAMP的比值無顯著性變化,這一指標常用于判定是否陰虛的依據(jù)[24]。黃芪生脈飲、顆粒對陰虛小鼠血漿中cAMP和cGMP含量的影響如表6所示。由表6可知:與正常組相比,模型組肌肉組織中cAMP和cGMP含量均升高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),cAMP與cGMP的比值增加,但無統(tǒng)計學(xué)意義,符合陰虛小鼠模型的特點;與模型組相比各給藥組給藥后,cAMP濃度降低,黃芪生脈飲、顆粒低劑量組的效果最佳(p<0.001);陽性給藥組、黃芪生脈飲和顆粒低劑量給藥后,cGMP濃度降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),黃芪生脈飲、顆粒高劑量給藥后,cGMP濃度升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),說明黃芪生脈飲及顆粒能調(diào)節(jié)cAMP與cGMP的動態(tài)平衡。

表6 黃芪生脈飲、顆粒對陰虛小鼠血漿中cAMP和cGMP的影響

3.2.4 糖原的質(zhì)量分數(shù)測定

黃芪生脈飲、顆粒對小鼠糖原質(zhì)量分數(shù)的影響情況如表7所示。由表7可知:造模后模型組與正常組相比,肝臟中肝糖原質(zhì)量分數(shù)顯著升高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),該結(jié)果有待進一步探討,肌肉組織中肌糖原質(zhì)量分數(shù)降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);與模型組相比,陽性給藥組給藥后,肝糖原質(zhì)量分數(shù)無明顯變化(p>0.05),肌糖原質(zhì)量分數(shù)增加,具有顯著性差異(p<0.01);黃芪生脈飲、顆粒低劑量給藥后,肌糖原質(zhì)量分數(shù)降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),肝糖原質(zhì)量分數(shù)無明顯變化;黃芪生脈飲、顆粒高劑量給藥后,肝糖原、肌糖原的質(zhì)量分數(shù)升高,具有極顯著性差異(p<0.001)。與陽性組相比,黃芪生脈飲、顆粒低劑量給藥后,肝臟中肝糖原的質(zhì)量分數(shù)無顯著性變化,但黃芪生脈飲、顆粒高劑量給藥后,肝臟中肝糖原的質(zhì)量分數(shù)顯著性增加,肌糖原的質(zhì)量分數(shù)顯著性增加,說明黃芪生脈飲、顆?？墒龟幪撔∈蟮募√窃謴?fù),增加肝糖原的儲備,且可能呈一定的劑量關(guān)系,黃芪生脈飲與黃芪生脈顆粒兩組給藥無顯著性變化,因此低、高劑量的黃芪生脈飲、顆粒均有提高陰虛體質(zhì)小鼠抗疲勞的功能。

表7 黃芪生脈飲、顆粒對小鼠糖原質(zhì)量分數(shù)的影響

4 結(jié) 論

運動耐力是反映機體疲勞客觀的指標,實驗結(jié)果表明氣虛、陰虛兩模型黃芪生脈系列給藥組的小鼠力竭游泳時間均明顯長于模型組,說明黃芪生脈系列具有延緩疲勞的作用;cAMP和cGMP兩者呈拮抗性共同參與細胞反應(yīng)的調(diào)節(jié),黃芪生脈顆?？捎行Ц纳颇Ｐ徒M小鼠cAMP和cGMP代謝紊亂問題,在一定程度上佐證了黃芪生脈系列具有益氣活血,改善氣虛和陰虛的功效;一般糖原的質(zhì)量分數(shù)可以間接反映疲勞程度,肝糖原測定結(jié)果表明黃芪生脈系列可以明顯提高肝糖原的儲備量,且與模型組相比,其劑量也可提高小鼠肌糖原的量,但在陰虛模型組,與正常組相比,模型組肝糖原質(zhì)量分數(shù)上升,該結(jié)果有待進一步探討;在一定范圍內(nèi)體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系,氣虛模型組實驗結(jié)果表明一定劑量黃芪生脈飲能夠增加小鼠吞噬指數(shù),加快碳粒廓清的速度,提示黃芪生脈飲可能通過提高機體非特異性免疫的途徑來增強免疫力,提高機體對有害刺激的防御作用。筆者研究結(jié)果初步闡明了黃芪生脈系列對氣虛、陰虛的作用機制,為其深入開發(fā)利用提供了參考依據(jù),但更具體的作用機制還有待進一步研究。