袁 霞，劉方慶，文隴英，徐 婧，廖光祥，王強勝，王 湘

（西南山地瀕危鳥類保護四川省高等院校重點實驗室/樂山師范學院，四川樂山 614000）

生物多樣性由遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性三個部分組成，既包括生物個體及其攜帶的遺傳信息，也包括它們與生態(tài)環(huán)境所組成的生態(tài)系統(tǒng)，以及各組分間的相互聯(lián)系[1]。遺傳多樣性可以作為進一步分析生物個體在遺傳進化方面的潛能和對環(huán)境的適應能力等各方面特征的重要基礎數(shù)據(jù)之一[2]。一個地區(qū)的物種遺傳多樣性越豐富，該物種對環(huán)境的適應能力越強，在生存和進化方面也具有更大的優(yōu)勢[3]。

地方家禽種質遺傳資源是畜禽遺傳多樣性的重要組成部分，是對地方禽類進行品種改良和可持續(xù)開發(fā)利用的重要依據(jù)[4]。隨著國內經(jīng)濟的快速發(fā)展，引進外來種類（品種）逐漸增多；這些外來優(yōu)良資源在豐富當?shù)匦笄萜贩N資源的同時，也會對當?shù)卦行笄萜贩N資源多樣性的保護造成沖擊和破壞[5]。例如我國本土豬在大量引進進口白豬的情況下，面臨著逐年減少甚至滅絕的情況[6-7]。地方品種雖然在生產(chǎn)性能方面比不上引進品種，但其優(yōu)良的肉質品質和獨特的風味遠遠優(yōu)于引進品種，尤其是我國地方禽畜品種資源在遺傳育種方面還可能具有較高的研究利用價值[8]。通過研究家禽的遺傳結構多樣性和家禽群體遺傳距離可以初步查明家禽各種類型間的共同起源歷史及親緣關系，對合理地使用資源及有效保存家禽地方品種資源、建立優(yōu)良基因庫有著重要的參考意義，是家禽遺傳資源管理中的重要環(huán)節(jié)[9]。

峨眉黑雞（Gallus gallus）為原雞屬紅原雞種的一個地方亞種，是一種肉蛋兼用型品種，不僅具有豐富的營養(yǎng)價值，還兼有藥用價值和觀賞價值，是四川峨眉山地區(qū)養(yǎng)殖數(shù)量較多的黑雞優(yōu)秀品種；屬于四川山地烏雞的兩大品系之一[10]。峨眉黑雞主要分布在峨眉山市的龍池、大為、龍門，樂山市沙灣區(qū)的范店、軫溪及峨邊縣的毛坪、共和等鄉(xiāng)鎮(zhèn)；主產(chǎn)區(qū)為峨眉山西南大渡河沿岸的三縣交界處[11]。

峨眉黑雞全基因組重測序實現(xiàn)了遺傳進化分析及重要性狀候選基因的預測[12]，但針對其遺傳多樣性及品種形成的歷史研究內容還較少。目前，以mtDNA 序列為分子標記運用DNA 直接測序的方法，研究家禽遺傳多樣性[13-18]和系統(tǒng)分化[19-22]及起源的研究報道越來越多。本研究通過以峨眉山特有雞種峨眉黑雞作為研究對象，以線粒體DNA 細胞色素c 氧化酶亞基I(cytochromecoxidase I,COI)和細胞色素b(cytochromeb)兩個基因為分子標記，通過采集三個地點的峨眉黑雞群體樣本，分析種群遺傳多樣性與遺傳結構，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，為峨眉黑雞種質資源的科學保存和可持續(xù)性利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

1.1.1 樣品采集

21 只峨眉黑雞分別來自峨眉山市三個的雞場：峨眉山市世海黑雞原種雞場（E1），峨眉山市遠大林下放養(yǎng)雞場（E2），峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場（E3）。樣品編號見表1。所有個體用含有20 μL 抗凝血劑（EDTA 和0.75%生理鹽水按3%～4%比例配制而成）的抗凝管進行翅下靜脈采血，采樣體積為0.3 mL，放置于-20 ℃冰箱保存。

表1 峨眉黑雞采樣地點及數(shù)量

1.1.2 DNA提取

使用天根組織/血液試劑盒（北京天根）提取基因組上的DNA序列[22]。

1.2 引物信息及PCR擴增

參照文獻[23]選取合適的引物（見表2）。線粒體DNA 中的Cytb基因擴增引物為Cytb-H16064、Cytb-L14731，線粒體DNA 中的COI基因擴增引物為COIL6615、COI-H7956；其中L 表示輕鏈，H 表示重鏈；序列的順序均為5′—3′方向。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物序列信息

以提取的基因組DNA 作為模板，進行PCR 擴增。PCR 反應體系為25 μL，包括模板DNA 2 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA 聚合酶（Taq 酶）12.5 μL（含dNTP、Mg2+、Buffer 緩沖液）、上下游引物各1 μL，反應體系在Easycycler Gradient 96 型與SelectCycler Ⅱ型PCR 儀上進行反應[24]。

PCR 反應要求：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，45～46 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；將擴增好的PCR 產(chǎn)物放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹24]。

1.3 PCR擴增產(chǎn)物的純化與測序

將擴增好的PCR 產(chǎn)物取4～5 μL 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測[24]，將擴增成功的產(chǎn)物和相應的引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司(成都分公司)進行分離純化和雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1）將獲得的DNA 雙向測序數(shù)據(jù)根據(jù)峰圖人工校對測序結果，用DNAMAN 軟件拼接、比對和剪切[25]，生成對應的線粒體COI、Cytb 全序列文件后，通過在NCBI 上執(zhí)行BLAST 相似性檢索，以保證得到的序列為目的基因片段。

2）用Bioedit 對DNA 序列進行比對、拼接和校正[26]。

3）用DNAsp 生成單倍型，并計算單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)及核苷酸平均差異數(shù)（Average number of nucleotide differences,K）[27]。

4）對線粒體DNACytb 和COI 這兩個目的片段基因及串聯(lián)成的DNA 片段分別構建以下兩種系統(tǒng)發(fā)育樹：用PAUP4.0 的鄰近結合法構建NJ（Neighbor joining）樹[28]；用MrBayes 3.2 的貝葉斯（Bayesian）推斷法構建貝葉斯樹[29]。

2 結果與分析

2.1 堿基組成

三個采樣點的峨眉黑雞基因片段的堿基組成測試結果為：COI序列片段中A+T 的百分比高于G+C，堿基G 含量最低（見表3）；Cytb序列片段A+T 含量較高，堿基C 含量最高（見表4）；串聯(lián)片段中A+T 的含量高于G+C的含量（見表5）。

表3 峨眉黑雞COI基因堿基組成 單位：%

表4 峨眉黑雞Cytb基因堿基組成 單位：%

（續(xù)表4）

表5 峨眉黑雞Cytb和COI基因串聯(lián)片段的堿基組成 單位：%

2.2 遺傳多樣性

2.2.1 遺傳多樣性指數(shù)

COI基因有效測序長度為846 bp，其中包含549個變異位點、397個缺失位點、1個簡約信息位點，兩堿基變異數(shù)為1 個，三堿基變異數(shù)為1 個。共定義了12種單倍型。

Cytb基因有效測序長度為1 005 bp，其中包含554個變異位點、451個缺失位點、8個簡約信息位點，兩堿基變異數(shù)為5 個，三堿基變異數(shù)為3 個。共定義了6 種單倍型。

按照文獻[30]提出的標準，單倍型多樣性以0.5 為臨界值，核苷酸多樣性以0.005 為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。本測試結果（見表6～表8）顯示：采樣于峨眉山市世海黑雞原種雞場的種群（E1）在三個種群中遺傳多樣性最低；采樣于峨眉山市遠大林下放養(yǎng)雞場的種群（E2）的核苷酸多樣性及核苷酸平均差異數(shù)最高；采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場的種群（E3）的單倍型多樣性較高，核苷酸多樣性較低。

表6 峨眉黑雞COI基因的遺傳多樣性指數(shù)

表7 峨眉黑雞Cytb基因的遺傳多樣性指數(shù)

表8 峨眉黑雞Cytb和COI基因串聯(lián)片段的遺傳多樣性指數(shù)

2.2.2 遺傳距離

測試結果顯示，峨眉黑雞三個地區(qū)雞種間基因的遺傳距離（DA）如下：1）Cytb基因片段，E1 和E2 兩個種群的遺傳距離為0.002 9，E1 和E3 兩個種群的遺傳距離為0.002 7，E2和E3兩個種群的遺傳距離為0.002 8。2）COI基因片段，E1 和E2 兩個種群的遺傳距離為0.000 8，E1和E3兩個種群的遺傳距離為0.000 4，E2和E3兩個種群的遺傳距離為0.000 5。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

基于本研究測得的21 條峨眉黑雞序列Dnasp 5 分析得到3 個采樣地點的峨眉黑雞COI基因序列共有11 種單倍型，Cytb基因序列共有5 種單倍型；采用鄰接法（NJ）和貝葉斯推論法（BI）構建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹。

COI：1）NJ樹。單倍型H2、H3、H5聚在一起形成姊妹分支，H1、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11 單獨形成一支（見圖1）。2）BI 樹。所有單倍型均單獨形成分支（見圖2）。

圖1 峨眉黑雞COI基因NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 峨眉黑雞COI基因BI系統(tǒng)發(fā)育樹

Cytb：1）NJ 樹。單倍型H2 和H4 聚在一起形成姊妹分支，H3和H5聚在一起形成姊妹分支，H1單獨形成分支（見圖3）。2）BI 樹。H3 和H5 聚在一起形成姊妹分支，H1、H2、H4 均單獨形成分支（見圖4）。

圖3 峨眉黑雞Cytb基因NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 峨眉黑雞Cytb基因BI系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論與討論

3.1 結論

群體內反饋線粒體DNA 變異水平程度的兩個關鍵要素是單倍型多樣性（Hd）及核苷酸多樣性（Pi），兩者的值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富，群體的多樣性程度也越高[31]，群體可供選擇的育種素材就越多，對將來變化多端的自然環(huán)境的適應潛力也越大[32]。Cytb序列的多樣性（Hd=[0.667,0.905]，Pi=[0.002 35,0.005 14]）明顯高于COI序列的多樣性（Hd=[0.286,0.524]，Pi=[0.000 71,0.0.001 05]），可能是由于COI基因相對保守，而Cytb基因突變率較高。對兩個基因片段及串聯(lián)序列多樣性的計算結果顯示，采樣于峨眉山市世海黑雞原種雞場的種群在三個種群中遺傳多樣性最低；采樣于峨眉山市遠大林下放養(yǎng)雞場的種群的核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)最高；采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場的種群單倍型多樣性較高，核苷酸多樣性較低。本研究結果表明，以原雞（Gallus）為外群，兩種分析方法得到的系統(tǒng)發(fā)育樹的結構基本一致；來自不同地區(qū)的三個種群的單倍型未按照地理位置各自聚類，而是相互混雜在一起，進化關系不明顯。

COI基因片段的遺傳多樣性分析顯示出單倍型多樣性（Hd）在0.286～0.524，核苷酸多樣性（Pi）在0.000 71～0.001 05，核苷酸平均差異數(shù)（K）在0.571 43～0.857 14。總體而言，在該基因片段序列中三個種群單倍型多樣性及核苷酸多樣性數(shù)值較低，本片段的三個種群遺傳多樣性數(shù)值均較低（Pi＜0.100）。Cytb基因片段的遺傳多樣性分析顯示出單倍型多樣性（Hd）在0.667～0.905，核苷酸多樣性（Pi）在0.002 35～0.005 14，核苷酸平均差異數(shù)（K）在1.809 52～4.285 71。采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場的種群單倍型多樣性較高（Hd=0.905＞0.900），采樣于峨眉山市遠大林下放養(yǎng)雞場的種群序列核苷酸平均配對差異最高（K=4.285 71）。Cytb和COI基因串聯(lián)片段的遺傳多樣性分析顯示出單倍型多樣性（Hd）在0.810～0.905，核苷酸多樣性（Pi）在0.001 14～0.005 14，核苷酸平均差異數(shù)（K）在1.809 52～4.285 71。采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場的種群單倍型多樣性較高（Hd=0.905＞0.900），采樣于峨眉山市遠大林下放養(yǎng)雞場的種群序列核苷酸平均配對差異最高（K=5.047 62）。

遺傳距離是分析2 個不同種群或親緣關系較近的物種之間遺傳差異的一種方法，一般是利用2 個種群不同位點的等位基因頻率數(shù)據(jù)來計算的[33]。本研究結果表明，無論是基于Cytb基因還是COI基因，采樣于峨眉山市鴻飛養(yǎng)雞場與峨眉山市世海黑雞原種雞場的種群遺傳距離都最?。ㄟz傳距離分別為0.002 7 和0.000 4），即親緣關系最近；采樣于峨眉山市世海黑雞原種雞場與峨眉山市遠大林下放養(yǎng)雞場的種群遺傳距離最大(遺傳距離分別為0.000 4 和0.000 8)，即親緣關系最遠；但總體親緣關系都較近。

3.2 討論

研究結果表明，峨眉黑雞的遺傳多樣性較低，三個地區(qū)間種群親緣關系都較近，推測可能產(chǎn)生該結果的原因是由于目前進行保種的峨眉黑雞群體是來自2002 年峨眉種雞的少量育種群體，這些雞種大部分來自當?shù)氐霓r戶，與其他外來雞種的基因交流可能性較小，所以種群親緣關系較近，其變異程度較低；除此之外，由于基礎種群數(shù)目相對較少，并且大部分在2002 年之前缺乏系統(tǒng)性的保種措施，小群體中的遺傳漂變也可能會造成整體遺傳多樣性的缺失，發(fā)生在封閉群體中有效群體數(shù)量的下降也會提高基因漂變的速率，進而減少小群體的遺傳多樣性[34]。因此，未來為確保峨眉黑雞的可持續(xù)性開發(fā)利用，需加強對其種質資源的保護，減少這一品種的優(yōu)良性狀丟失。