趙煥煥，楊紅芳，李俊玉，李志偉，白 雪，葛鐘桓，周 梅，李 利△

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科，石家莊 050011；2.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，石家莊 050018；3.河北省滄州市南皮縣醫(yī)院婦科 061500)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)達(dá)國(guó)家中最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其中Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌為雌激素依賴型，大多數(shù)與肥胖和代謝綜合征密切相關(guān)，Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌為非激素依賴型，與雌激素刺激關(guān)系不大[1]。通常認(rèn)為Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌是通過(guò)子宮內(nèi)膜前體病變及分子遺傳學(xué)改變的累積而發(fā)展的[2]，2014年第4版世界衛(wèi)生組織(WHO)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類中將子宮內(nèi)膜病變分為兩大類：非典型性增生/子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變(AH/EIN)和不伴非典型性增生[3]。臨床觀察表明，子宮內(nèi)膜非典型性增生與子宮內(nèi)膜長(zhǎng)期受雌激素刺激有關(guān)，并且子宮內(nèi)膜非典型性增生進(jìn)展為Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)約30%[4]。因此，區(qū)分子宮內(nèi)膜伴與不伴非典型性增生具有重要的臨床意義，迄今為止，子宮內(nèi)膜增生的診斷和隨訪需要侵入性手術(shù)[5]。

目前，子宮內(nèi)膜癌及癌前病變?nèi)狈γ舾行约疤禺愋暂^高的血清腫瘤標(biāo)志物，探索更多的標(biāo)志物對(duì)于子宮內(nèi)膜癌及癌前病變的診治有很高的臨床價(jià)值[6]。質(zhì)譜法測(cè)量?jī)?nèi)源激素的使用為此類研究開(kāi)辟了新的研究途徑，該方法除了靈敏度高、準(zhǔn)確度高和具有可重復(fù)性之外，其還能夠同時(shí)測(cè)量雌激素代謝產(chǎn)物[7]。筆者前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)尿液中雌二醇(E2)、4-羥雌二醇(4-OHE2)、雌酮(E1)、2-甲氧雌二醇(2-MeOE2)、16α-羥雌酮(16α-OHE1)可作為子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤標(biāo)志物[8]，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道雌激素及其代謝產(chǎn)物在子宮內(nèi)膜非典型性增生患者中表達(dá)情況的研究，本研究采用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜非典型性增生患者的血清中雌激素及其代謝產(chǎn)物水平，探討血清中雌激素及其代謝產(chǎn)物水平在子宮內(nèi)膜非典型性增生患者血清中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2020年1月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科就診的異常子宮出血并疑似子宮內(nèi)膜病變患者，經(jīng)宮腔鏡檢查及子宮內(nèi)膜病理活檢確診為子宮內(nèi)膜不伴非典型性增生患者80例(不伴非典型性增生組)，患者平均年齡為(40.5±6.5)歲，其中非肥胖組45例，肥胖組35例，收集陰道出血期的血清標(biāo)本；子宮內(nèi)膜活檢證實(shí)為子宮內(nèi)膜非典型性增生患者，并且經(jīng)子宮切除手術(shù)術(shù)后病理確診為子宮內(nèi)膜非典型性增生患者70例(非典型性增生組)，收集陰道出血期的血清標(biāo)本，患者平均年齡為(47.8±1.92)歲；其中非肥胖組39例，肥胖組31例，收集陰道出血期的血清標(biāo)本；所有研究對(duì)象手術(shù)前至少3個(gè)月未接受藥物療法，并簽署研究知情同意書(shū)。選擇同期來(lái)該院行體檢的絕經(jīng)前婦女60例為對(duì)照組，經(jīng)過(guò)B超評(píng)判子宮內(nèi)膜無(wú)增厚，無(wú)異常出血，月經(jīng)規(guī)律，既往無(wú)子宮內(nèi)膜病變的健康人60例，平均年齡為(42.6±3.8)歲，其中非肥胖組30例，肥胖組30例，收集月經(jīng)來(lái)潮第2～3天血清標(biāo)本。排除吸煙、乳腺疾病、婦科腫瘤及其他激素有關(guān)的腫瘤，合并高血壓或糖尿病者，合并嚴(yán)重心肝腎肺疾病者，合并急慢性感染者。其中BMI≥25 kg/m2定義為肥胖。

1.2 主要試劑與儀器

AB 4500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(Triple Quad 4500/LC-20AD)購(gòu)自美國(guó)Sciex公司；電子天平Q65-1CN購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；乙腈、甲醇購(gòu)自德國(guó)Merck公司；甲酸、正辛醇、丙酮、氫氧化鈉、鹽酸購(gòu)自天津大茂公司；E2標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich工資；E1標(biāo)準(zhǔn)品、4-OHE2標(biāo)準(zhǔn)品、16α-OHE1標(biāo)準(zhǔn)品、2-MeOE2標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自加拿大TRC公司。

1.3 方法

1.3.1血清采集

收集清晨空腹血樣標(biāo)本4 mL,置于促凝管中，加入20 μL維生素C防止氧化，2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，并以2000 r/min離心10 min后，分離血清，將血清保存在-80 ℃直至使用。

1.3.2超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)方法

1.3.2.1色譜條件

色譜柱：Luna Omega 3 μm polar C18 100 mm×2.1 mm，柱溫40 ℃；流動(dòng)相A相0.1% 甲酸水溶液,B相0.1% 甲酸乙腈溶液；流速0.4 mL/min，梯度為1 min為-90% A，10 min為-40% A，11～12 min為-90% A，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

(1)量取各標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)溶液(除E2)50 μL、雌二醇500 μL，混合，用10%乙腈稀釋至5 mL，即各激素濃度均為10 μg/mL。(2)取對(duì)照儲(chǔ)備液50 μL，用10%乙腈稀釋至1 mL，即得500 ng/mL血清樣品；(3)取溶液(2)200 μL，用10%乙腈稀釋至1 mL，即得100 ng/mL血清樣品；(4)取溶液(2)100 μL，用10%乙腈稀釋至1 mL，即得50 ng/mL血清樣品；(5)取溶液(4)200 μL，用10%乙腈稀釋至1 mL，即得10 ng/mL血清樣品。

1.3.2.3樣品制備

取血清樣品1.0 mL，加入2.0 mL乙腈，渦旋5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用氮吹儀吹干后，再用100 μL 10%乙腈復(fù)溶，分別取上述溶液10 μL進(jìn)UPLC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2.4方法驗(yàn)證

通過(guò)UPLC-MS方法分析來(lái)評(píng)估方法的精確度和準(zhǔn)確度，準(zhǔn)確度用相對(duì)誤差(RE)來(lái)確定，計(jì)算公式：RE%=[(測(cè)定值-理論值)/理論值]×100%。E2的回收率為91.2～95.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.2～7.9%；4-OHE2回收率為109%～110%，RSD為2.6%～5.2%；2-MeOE2回收率為100%～102%，RSD為7.0～8.4%；E1回收率為97.2%～102.6%，RSD為5.6～8.1%；16α-OHE1回收率為102.4%～103.9%，RSD為7.0%～8.4%。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用加權(quán)直線回歸法得出校準(zhǔn)方程；在0.1～1 000 ng/mL濃度范圍內(nèi)擬合曲線方程。E2方程為：Y=3 847.87X+1 541.85(r=0.999 96) ；4-OHE2方程為：Y=5.618 9×104X+1.110 3×105(r=0.999 98)；2-MeOE2方程為：Y=3.457 0×104X+1.586 9×105(r=0.999 97)；E1方程為：Y=3 717.67X+28 880.01(r=0.999 94)；16α-OHE1方程為：Y=5 405.96X+15 179.68(r=0.999 98)，其中X為對(duì)照品濃度、Y為曲線下面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組中肥胖與非肥胖組血清中雌激素及其代謝產(chǎn)物水平比較

在對(duì)照組絕經(jīng)前婦女中，非肥胖組中E2、E1、E2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1水平明顯均低于肥胖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。

E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1單位均為μg/mL，其余指標(biāo)無(wú)單位；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.2 非肥胖患者雌激素及其代謝產(chǎn)物水平在各病理類型子宮內(nèi)膜病變患者中的比較

在非肥胖絕經(jīng)前婦女中，E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1在對(duì)照組、不伴非典型性增生組、非典型性增生組表現(xiàn)出增高趨勢(shì)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，非典型性增生組E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1、4-OHE2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1均明顯高于對(duì)照組及不伴非典型性增生組(P<0.05)；2-MeOE2水平在對(duì)照組、不伴非典型性增生組及非典型性增生組表現(xiàn)出降低趨勢(shì)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)：非典型性增生組2-MeOE2、E2/E1均明顯低于對(duì)照組及不伴非典型性增生組均明顯高于(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1單位均為μg/mL，其余指標(biāo)無(wú)單位；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.3 肥胖患者雌激素及其代謝產(chǎn)物水平在各病理類型子宮內(nèi)膜病變患者中比較

在肥胖絕經(jīng)前婦女中，E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1、E2/2-MeOE2、4-OHE2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1在對(duì)照組、不伴非典型性增生組及非典型性增生組表現(xiàn)出增高趨勢(shì)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，非典型性增生組患者E2、4-OHE2、E2/2-MeOE2、4-OHE2/2-MeOE2、E1、16α-OHE1、E1/16α-OHE1均明顯高于對(duì)照組及不伴非典型性增生組(P<0.05)；2-MeOE2水平在對(duì)照組、不伴非典型性增生組及非典型性增生組表現(xiàn)出降低趨勢(shì)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，非典型性增生組患者2-MeOE2、E2/E1在均明顯低于不伴非典型性增生組及對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1單位均為μg/mL，其余指標(biāo)無(wú)單位；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.4 子宮內(nèi)膜非典型增生多因素logistics回歸分析和ROC分析。

以子宮內(nèi)膜非典型增生為不良結(jié)局，將雌激素及其代謝產(chǎn)物納入多因素logistics回歸分析，結(jié)果顯示16α-OHE1是發(fā)生子宮內(nèi)膜非典型增生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，E2、4-OHE2、2-MeOE2、E1、E2/E1、E2/2-MeOE2、4-OHE2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1與子宮內(nèi)膜非典型增生的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05),見(jiàn)表1。16α-OHE1回歸模型ROC曲線下面積(AUC)為0.897[P=0.038,95%CI(0.822,0.972)]，具有良好的診斷效能，見(jiàn)圖4。

表1 子宮內(nèi)膜非典型增生多因素logistics回歸分析

圖4 16α-OHE1 ROC 曲線分析

3 討 論

子宮內(nèi)膜非典型性增生為子宮內(nèi)膜癌前病變的主要形式，目前認(rèn)為子宮內(nèi)膜非典型性增生主要與雌激素持續(xù)刺激子宮內(nèi)膜組織有關(guān)[9]，但是對(duì)于雌激素代謝產(chǎn)物與子宮內(nèi)膜非典型性增生的關(guān)系尚無(wú)研究，本研究旨在分析雌激素及其代謝產(chǎn)物濃度變化與子宮內(nèi)膜非典型性增生發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜非典型性增生的生物學(xué)標(biāo)志物，并應(yīng)用于臨床。卵巢分泌的雌激素是絕經(jīng)前女性體內(nèi)雌激素的主要來(lái)源，以E2的形式作用于器官靶點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)E2及其代謝產(chǎn)物在卵泡早期(月經(jīng)干凈后2～6 d)，卵泡中期(月經(jīng)干凈后2～16 d)，排卵期(排卵日前5 d至排卵日后5 d)，黃體中期檢測(cè)值有明顯的不同，因此本試驗(yàn)收集的是婦女月經(jīng)期第2～3天的血清標(biāo)本[10]。

肥胖女性體內(nèi)通過(guò)子宮內(nèi)膜和脂肪組織內(nèi)的芳香化作用將過(guò)多的雄激素轉(zhuǎn)化為可生物利用的雌激素，間接地導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[11]。研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重肥胖(BMI>30 kg/m2)使子宮內(nèi)膜癌患病率增加3倍[12]。本研究通過(guò)檢測(cè)絕經(jīng)前的正常無(wú)子宮內(nèi)膜增生病變婦女的血清標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，E2、E1在肥胖婦女血清中水平明顯高于非肥胖婦女；這也說(shuō)明了長(zhǎng)時(shí)間的肥胖可能會(huì)增加子宮內(nèi)膜病變的風(fēng)險(xiǎn)；通過(guò)檢雌激素及其代謝產(chǎn)物可指導(dǎo)其健康的生活方式，減輕體重，從而預(yù)防子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生。

E2和E1通過(guò)與其受體合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂及基因的突變，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[13]。CYP1B1 將雌激素第4位上的碳原子羥化生成4-OHE2，且4-OHE2使大鼠患子宮內(nèi)膜癌的概率是E2的9倍[14]。研究表明4-OHE2可通過(guò)磷?；焖偌せ罴?xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)通路，導(dǎo)致Raf基因突變，從而可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[14]，因此4-OHE2在誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)E2、E1、4-OHE2在非典型性增生組患者中明顯高于其他組，說(shuō)明4-OHE2可促進(jìn)子宮內(nèi)膜向非典型性增生病變的發(fā)生。

16α-OHE1是在雌激素的第16位碳原子(C-16)發(fā)生羥化反應(yīng)生成的，其中CYP3A4酶在C-16羥化過(guò)程中起主要作用[15]。研究表明，16α-OHE1可與雌激素受體結(jié)合促進(jìn)癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致DNA的損傷和腫瘤的發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)16α-OHE1水平在子在非典型性增生組患者明顯升高，說(shuō)明16α-OHE1在子宮內(nèi)膜發(fā)生非典型性病變過(guò)程中起促進(jìn)作用。本研究在多因素logistics分析模型中發(fā)現(xiàn)16α-OHE1是子宮內(nèi)膜發(fā)生非典型增生的高危因素，因此監(jiān)測(cè)16α-OHE1水平對(duì)于子宮內(nèi)膜非典型增生的診斷具有重要的價(jià)值。

2-MeOE2是內(nèi)源性雌激素在第2位碳原子發(fā)生羥基化及甲基化生成的代謝產(chǎn)物。兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)將2-OHE2和2-OHE1轉(zhuǎn)變成2-MeOE2和2-MeOE1。COMT在子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，降低雌激素水平，抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究中，2-MeOE2在非典型性增生組明顯降低，說(shuō)明2-MeOE2可抑制子宮內(nèi)膜非典型性增生的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，E2/2-MeOE2、4-OHE2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1在非典型性增生組明顯升高，E2/E1在非典型性增生組明顯降低，說(shuō)明子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生與高雌激素和激素代謝的不平衡有密切關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)E2及其代謝產(chǎn)物的變化在子宮內(nèi)膜病變中異常表達(dá)及監(jiān)測(cè)16α-OHE1水平對(duì)于子宮內(nèi)膜非典型增生的診斷具有一定的價(jià)值。本研究創(chuàng)新性探討雌激素及其代謝產(chǎn)物在子宮內(nèi)膜非典型性增生患者中表達(dá)情況，為子宮內(nèi)膜非典型性增生的預(yù)防及診斷提供一個(gè)新的參考指標(biāo)。在對(duì)子宮內(nèi)膜非典型增生的患者保留生育功能治療時(shí)，對(duì)E2及其代謝產(chǎn)物的變化的隨訪，可以對(duì)疾病的診斷及治療起指導(dǎo)作用。對(duì)于E2及其代謝產(chǎn)物的異常變化給予積極治療，可預(yù)防子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生。