周佳木，張貝貝，王艷歌，胡旭萌，葛可可，李盼，宋宗明

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院/河南省立眼科醫(yī)院/河南省眼科研究所 眼科，河南 鄭州 450003)

隨著高通量測(cè)序技術(shù)及分子生物學(xué)的發(fā)展，基因編輯技術(shù)在疾病治療中的應(yīng)用不斷增加，人們希望通過(guò)研究基因的功能、敲除致病基因或插入保護(hù)基因，達(dá)到治愈疾病的目的。因此，全面探索基因的功能成為時(shí)下熱議的話(huà)題。簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)全基因組篩選技術(shù)可直接作用于所有編碼或非編碼序列，快速篩選具有特定生物學(xué)功能的基因或DNA片段，主要用于研究各類(lèi)疾病機(jī)制、藥物開(kāi)發(fā)、非編碼序列功能及剖析基因功能關(guān)系[1]。

與其他器官或系統(tǒng)相比，眼球具有體積小、范圍局限等生理結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，在使用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)或慢病毒等載體時(shí)不會(huì)引起全身反應(yīng)，中央角膜因沒(méi)有血管而免疫赦免，這有利于維持基因編輯載體的活性，眼球在各種基因編輯的探索中具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。本文綜述了全基因組篩選技術(shù)在疾病治療研究中的應(yīng)用進(jìn)展及CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在各類(lèi)眼病中的廣泛應(yīng)用，對(duì)全基因組篩選技術(shù)未來(lái)在眼科的應(yīng)用提出展望，同時(shí)剖析了這種方法存在的問(wèn)題和未來(lái)發(fā)展方向，以期為眼科疾病基因編輯治療的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)及全基因組篩選的原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是從細(xì)菌免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種高效靈活的基因組編輯工具，由一個(gè)單鏈向?qū)NA(single guide RNA，sgRNA)和一個(gè)具有核酸內(nèi)切酶功能的Cas9蛋白組成。在sgRNA特異性識(shí)別下，Cas9蛋白到達(dá)基因組特定位點(diǎn)，對(duì)雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)進(jìn)行切割[2]，產(chǎn)生雙堿基鍵斷裂(double strand breaks，DSB)。此后，dsDNA通過(guò)細(xì)胞自主性的非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源重組(homology directed repair，HDR)引入突變[3-4]。2013年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次在真核生物DNA編輯及修飾中發(fā)揮作用[5]。另外，通過(guò)改造可使核酸內(nèi)切酶失活形成失活cas9(nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)，dCas9不能對(duì)DNA進(jìn)行切割，但保留了特異性結(jié)合能力，可將不同的功能結(jié)構(gòu)域融合到dCas9蛋白上，使它們發(fā)揮更多功能，如單核苷酸編輯、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)[6]。例如dCas9通過(guò)在轉(zhuǎn)錄起始部位融合或招募轉(zhuǎn)錄因子，形成CRISPR激活(CRISPR activation，CRISPRa)和 CRISPR抑制(CRISPR interference，CRISPRi)，可特定地激活或抑制轉(zhuǎn)錄。

通過(guò)設(shè)計(jì)和合成不同sgRNA靶向細(xì)胞的全基因組序列，在細(xì)胞群內(nèi)高通量地靶向敲除目的基因，并置于特定環(huán)境中進(jìn)行陰性或陽(yáng)性篩選，利用二代測(cè)序識(shí)別影響細(xì)胞活性的功能基因。CRISPR/Cas9全基因組篩選的具體步驟包括設(shè)計(jì)構(gòu)建sgRNA文庫(kù)、慢病毒轉(zhuǎn)染、環(huán)境篩選、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。2014年建立了包含18 080個(gè)基因及64 751個(gè)獨(dú)特的引導(dǎo)序列的全基因組敲除文庫(kù)(genome-scale CRISPR/Cas9 knockout，GeCKO)與GeCKOv2[7-8]，成為人們進(jìn)行全基因組篩選的有利工具。

2 CRISPR/Cas9全基因組篩選在疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

2.1 惡性腫瘤相關(guān)研究CRISPR/Cas9全基因組篩選技術(shù)在惡性腫瘤中的研究主要應(yīng)用于以下方面。(1)篩查癌癥相關(guān)因子，尋找潛在治療靶點(diǎn)：腫瘤的發(fā)生往往與促癌基因的活化或抑癌基因的失活有關(guān)，相關(guān)的突變基因或調(diào)節(jié)因子是藥物治療的潛在靶點(diǎn)。如在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)研究中，通過(guò)對(duì)AML細(xì)胞系進(jìn)行CRISPR/Cas9全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)PAICS基因能夠抑制AML細(xì)胞增殖，因此PAICS及其相關(guān)基因?yàn)锳ML治療的潛在靶點(diǎn)[9]。(2)尋找癌癥治療中的合成致死靶點(diǎn)：基因突變的癌細(xì)胞在一些其他基因突變或抑制時(shí)發(fā)生死亡，通過(guò)篩選這些癌癥基因突變的驅(qū)動(dòng)因素，有利于進(jìn)一步推動(dòng)癌癥基因靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，同時(shí)為治療提供新途徑[10]。(3)尋找免疫治療的靶點(diǎn)：免疫細(xì)胞特異性基因缺失有助于更好地了解腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生中的作用，促進(jìn)腫瘤的免疫治療。2020年，Li等[11]通過(guò)體內(nèi)表觀遺傳學(xué)CRISPR篩查，確定了Asf1a是肺腺癌對(duì)抗PD-1治療敏感性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Asf1a被鑒定為Kras突變型肺腺癌的免疫治療新靶點(diǎn)。

2.2 疾病耐藥性研究隨著藥物的研發(fā)與廣泛應(yīng)用，耐藥性的發(fā)生是許多疾病治療過(guò)程中的“絆腳石”，CRISPR/Cas9全基因組篩選技術(shù)也被應(yīng)用于相關(guān)研究中。(1)篩選疾病耐藥相關(guān)的突變基因或調(diào)節(jié)因子，通過(guò)對(duì)比可發(fā)現(xiàn)耐藥時(shí)細(xì)胞分子水平的改變。如在一定濃度魯索利替尼的環(huán)境中對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)進(jìn)行全基因組CRISPR/Cas9篩查，發(fā)現(xiàn)CRKL的缺失增強(qiáng)了野生型細(xì)胞對(duì)魯索利替尼的敏感性[12]。(2)尋找其他敏感靶點(diǎn)：一些治療靶點(diǎn)的聯(lián)合用藥能夠顯著提高藥物敏感性，減少耐藥性的發(fā)生。Lan等[13]利用CRISPR/Cas9全基因組篩查確定胰腺癌放療的敏感靶點(diǎn)，并通過(guò)開(kāi)發(fā)放療增敏劑，為克服胰腺癌對(duì)放射治療的耐受性提供新的策略。(3)通過(guò)基因組轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：CRISPRa文庫(kù)及CRISPRi文庫(kù)在檢測(cè)耐藥基因方面同樣發(fā)揮重要作用。Cai等[14]利用CRISPRa文庫(kù)通過(guò)上調(diào)靶基因并誘導(dǎo)耐藥，發(fā)現(xiàn)LRP8基因可以驅(qū)動(dòng)HCC細(xì)胞獲得索拉非尼耐藥性。另外，Liu等[15]利用CRISPRi文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)lncGRS-1為加強(qiáng)膠質(zhì)瘤放射治療的特異性治療靶點(diǎn)。

2.3 病毒感染相關(guān)研究病毒感染是指病毒通過(guò)多種途徑侵入機(jī)體，并在易感的宿主細(xì)胞中增殖的過(guò)程，病毒可在體內(nèi)持續(xù)多年，對(duì)特定的組織、器官或系統(tǒng)造成損害。CRISPR全基因組篩選技術(shù)主要應(yīng)用于以下方面[16]。(1)研究病毒-宿主的相互作用：通過(guò)CRISPR/Cas9全基因組篩選可發(fā)現(xiàn)病毒感染過(guò)程中進(jìn)入擴(kuò)散[17]、復(fù)制[18]及病毒蛋白的穩(wěn)定性[19]相關(guān)的宿主基因或宿主因子，能夠靶向病毒感染過(guò)程，截?cái)嗖《九c宿主的連接，為病毒感染的治療奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)TRIM26的缺失會(huì)特異性損害丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)基因組復(fù)制，從而確定了TRIM26是HCV復(fù)制的宿主因子，有助于HCV動(dòng)物模型的建立[20]。(2)確定病毒感染的潛在治療靶點(diǎn)：病毒感染具有潛伏期，可躲避細(xì)胞免疫，因此找到維持潛伏期的因素至關(guān)重要。Rathore等[21]通過(guò)在人類(lèi)免疫缺陷病毒潛伏期細(xì)胞系模型中利用CRISPR/Cas9全基因組功能敲除進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)人類(lèi)免疫缺陷病毒潛伏期的潛在調(diào)節(jié)因子IWS1、POLE3、POLR1B、PSMD1和TGM2。(3)免疫學(xué)研究：一些免疫因子(如干擾素)能夠抑制病毒的感染過(guò)程。如通過(guò)全基因組CRISPR篩查，研究者發(fā)現(xiàn)IFI6通過(guò)防止病毒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)陷的形成來(lái)預(yù)防性保護(hù)未感染的細(xì)胞，從而達(dá)到抗病毒的目的[22]。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在眼科疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展及局限性

3.1 Leber先天性黑矇(Leber’s congenital amaurosis，LCA)LCA是一種嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳性的視網(wǎng)膜疾病，無(wú)特殊治療手段。目前已發(fā)現(xiàn)25個(gè)基因突變與80% LCA病例相關(guān)[23]，其中對(duì)Leber先天性黑矇10型(Leber congenital amaurosis 10，LCA10)中CEP290基因突變的研究最為深入。有研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種候選基因組編輯療法EDIT-101[24]，通過(guò)對(duì)IVS26序列突變兩側(cè)進(jìn)行切割，去除了突變產(chǎn)生的異常剪接供體，使CEP290基因恢復(fù)正常表達(dá)，目前EDIT-101療法已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[25]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因片段的特異性切割，改變CEP290基因的功能表達(dá)，有望成為治療LAC10的新途徑。

3.2 視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)RP以慢性進(jìn)行性視野缺損及色盲為主要特征，其治療大多采用對(duì)癥治療及手術(shù)治療，但效果不佳。目前已明確84個(gè)基因和7個(gè)候選基因與非綜合征性RP相關(guān)，這些基因突變引起光感受器的退化，從而影響視網(wǎng)膜功能。其中遺傳性RP分為常染色體顯性遺傳性RP(autosomal dominant RP，ADRP)、常染色體隱性遺傳性RP(autosomal recessive RP，ARRP)與X連鎖RP(X-linked RP，XLRP)。研究表明25%的ADRP由視紫紅質(zhì)(rhodopsin，RHO)基因的突變導(dǎo)致，而70%～90%的XLRP是視網(wǎng)膜色素變性三磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine triphosphate，GTP)酶調(diào)節(jié)基因(GTPase regulator，RPGR)突變導(dǎo)致[26]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向切割P23H突變模型小鼠體內(nèi)的RHO基因，減緩了光感受器的退化，改善了其視網(wǎng)膜功能[27]。2022年，Gumerson等[28]在自然突變的rd9小鼠體內(nèi)靶向切除移碼突變的OFR15基因后，恢復(fù)了部分光感受器中的RPGR基因功能，并且觀察到RPGR突變相關(guān)的早期標(biāo)志性疾病表型(如視錐蛋白的錯(cuò)誤定位)已不復(fù)存在。這些研究展示了RP基因治療的臨床前研究進(jìn)程及CRISPR/Cas9技術(shù)用于臨床研究的可行性。

3.3 原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)POAG是一種由于房水排出途徑受阻而導(dǎo)致眼壓增高、視野損害的不可逆性疾病，其發(fā)病隱蔽，早期可沒(méi)有任何癥狀。大約4%的歐美POAG患者被報(bào)道具有肌纖蛋白(myocilin，MYOC)基因突變。MYOC基因突變使蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，造成小梁網(wǎng)(trabecular meshwork，TM)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力增加，從而增高眼壓。實(shí)驗(yàn)表明，在具有MYOC突變的人類(lèi)TM細(xì)胞和小鼠模型中進(jìn)行特異性切割，能夠抑制突變MYOC的表達(dá)，從而降低眼壓，阻止青光眼的發(fā)展[29]。另有研究表明，POAG患者的TM和房水中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的表達(dá)比非POAG患者高約1倍[30]，特異性抑制TM細(xì)胞中TGF-β2的表達(dá)后，小鼠眼組織中TGF-β2水平降低，成功降低了小鼠的眼壓[31]。POAG家族是及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療該疾病的關(guān)鍵，而眼壓升高是其發(fā)生視野損害的關(guān)鍵因素，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明CRISPR/Cas9特異性基因切割可快速降低小鼠眼壓，因此基因編輯有望成為POAG治療的新途徑。

3.4 先天性白內(nèi)障(congenital cataract，CC)CC是一種嚴(yán)重的先天性致盲性疾病，若未及時(shí)治療，將嚴(yán)重影響患兒視力發(fā)育，盡管手術(shù)治療是有效的治療方式，但術(shù)后并發(fā)癥及術(shù)后維護(hù)十分復(fù)雜。根據(jù)報(bào)道，目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)266個(gè)基因突變與CC的發(fā)生有關(guān)[32]。研究表明，在Crygc基因顯性突變白內(nèi)障模型小鼠的受精卵中，通過(guò)敲除相關(guān)基因，校正了基因突變，其后代小鼠沒(méi)有出現(xiàn)白內(nèi)障[33]，說(shuō)明通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除變異基因后性狀可穩(wěn)定遺傳給后代。另外，實(shí)驗(yàn)證明水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)同樣參與晶狀體透明度的維持。Tang等[34]通過(guò)使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建AQP5相關(guān)基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠晶狀體在大約6個(gè)月時(shí)發(fā)生輕度渾濁。

3.5 單純皰疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)HSK是由角膜原發(fā)性或復(fù)發(fā)性單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus 1，HSV-1)感染引起的嚴(yán)重感染性角膜病，且具有潛伏性，易在機(jī)體抵抗力下降時(shí)反復(fù)發(fā)作。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以特異性在病毒基因組導(dǎo)入突變，從而降低病毒的活性，減輕病毒感染。ICP0和ICP4是HSV-1復(fù)制和再激活所需的2個(gè)重要基因。2020年，Chen等[35]以ICP0和ICP4作為靶點(diǎn)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)高效、安全地抑制Vero細(xì)胞和小鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)中的HSV-1增殖，證明了這種基于CRISPR/Cas9的基因編輯是抗復(fù)發(fā)性HSV-1感染的有效方法。

3.6 眼科疾病基因編輯研究的局限性在目前的眼科疾病基因治療的進(jìn)展中，研究者們能夠通過(guò)已有的各類(lèi)基因測(cè)序工具，獲得與某一疾病相關(guān)的部分特定基因序列，對(duì)已知的基因進(jìn)行精準(zhǔn)的基因編輯：在細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建疾病模型，通過(guò)靶向切割以驗(yàn)證基因功能、改變表達(dá)性狀等，部分研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。但其發(fā)展仍存在部分問(wèn)題：(1)在繁冗復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中，仍有大量編碼或非編碼序列的功能有待探索，基因之間的相互作用并不明確，這成為許多眼科疾病進(jìn)入臨床研究的重大阻礙；(2)包括結(jié)膜炎、角膜炎、眼內(nèi)炎、瞼緣炎、眼眶蜂窩織炎和淚囊炎等在內(nèi)的細(xì)菌性炎癥的治療主要是經(jīng)驗(yàn)性使用廣譜抗生素。然而，廣譜抗生素的全身應(yīng)用導(dǎo)致革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌對(duì)一些用于治療眼科感染藥物的耐藥性增加[36]，嚴(yán)重阻礙了疾病的治療。因此，掌握藥物敏感性規(guī)律或改善耐藥性，可有效預(yù)防和控制眼部感染。

4 CRISPR/Cas9全基因組篩選技術(shù)在眼科治療中的應(yīng)用展望

4.1 疾病的發(fā)病機(jī)制研究CRISPR/Cas9全基因組篩選技術(shù)對(duì)探索先天性及環(huán)境因素導(dǎo)致的眼科疾病的致病機(jī)理具有重要意義。盡管目前已有部分突變基因?yàn)槿藗兯?，但仍存在大量異?；蚣胺蔷幋a序列的功能有待闡述。如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生與Rb基因突變有關(guān)[37]，但部分基因突變患者會(huì)發(fā)生良性的視網(wǎng)膜瘤，或者發(fā)生其他的惡性腫瘤，如成骨肉瘤、小細(xì)胞肺癌等，并且不是所有患者均存在Rb基因突變。全基因組篩選技術(shù)將全面探索疾病的發(fā)病機(jī)制，為我們提供更多的潛在研究靶點(diǎn)。

4.2 基因治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9全基因組篩選技術(shù)在已知的突變基因基礎(chǔ)上探索疾病發(fā)生的協(xié)同作用基因或調(diào)節(jié)因子或?qū)ふ倚碌拿庖咧委煱悬c(diǎn)，將成為一些眼部疾病治療的新方向。另外，眼部惡性腫瘤的合成致死靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)將有助于惡性腫瘤的抑制和死亡。

4.3 耐藥性研究目前眼科最常見(jiàn)的細(xì)菌感染為表皮葡萄球菌與銅綠假單胞菌，其細(xì)菌分離物對(duì)四環(huán)素、左氧氟沙星、頭孢吡肟、氨芐西林等表現(xiàn)出較高耐藥性[36]。另外，不少患者已出現(xiàn)普遍耐藥。利用CRISPR/Cas9全基因組篩選技術(shù)對(duì)比藥物治療過(guò)程中的基因改變，揭示這些耐藥發(fā)生的分子機(jī)制，可指明藥物的進(jìn)一步研發(fā)方向和聯(lián)合用藥的治療靶點(diǎn)。

4.4 與CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能夠特異性識(shí)別并編輯目的基因，高效快速地驗(yàn)證基因功能，已在眼科疾病研究中得到廣泛應(yīng)用。全基因組篩選技術(shù)能夠快速篩選疾病表型相關(guān)基因，即為基因編輯提供可能的目的基因片段，這將大幅度擴(kuò)大基因功能探索的范圍，提升效率。盡管它們的應(yīng)用均受到脫靶效應(yīng)的影響，但目前已出現(xiàn)一些降低脫靶效應(yīng)的有效措施。

5 總結(jié)

綜上所述，CRISPR/Cas9全基因組篩選技術(shù)是一種可廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的基因表型篩選方法，能夠全面闡述疾病表型與基因改變的對(duì)應(yīng)關(guān)系，具有特異性強(qiáng)、高效便捷等不可替代的優(yōu)勢(shì)。與RNAi篩選不同，這種篩選技術(shù)將功能缺失突變引入基因組DNA，并且可以靶向調(diào)控整個(gè)基因組的元件，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子等。另外，RNAi通過(guò)mRNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，這種類(lèi)型的表達(dá)抑制是暫時(shí)、可恢復(fù)的[38]，而GeCKO文庫(kù)執(zhí)行基因敲除，在基因組中產(chǎn)生永久性的變化。目前，該技術(shù)在各系統(tǒng)腫瘤相關(guān)基因、化療藥物耐藥性、病毒感染治療及先天性疾病研究等方面已取得部分進(jìn)展，在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證[39]。但存在部分問(wèn)題有待解決：(1)目前常用的GeCKO文庫(kù)主要包括人源與鼠源，并且價(jià)格昂貴，抑制了其廣泛應(yīng)用及發(fā)展。若由實(shí)驗(yàn)室搭建文庫(kù)，則前期需要花費(fèi)大量的時(shí)間成本，將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度；(2)進(jìn)入細(xì)胞時(shí)依賴(lài)不同的載體，如慢病毒、AAV等，對(duì)于不同的細(xì)胞，不同載體的感染效率具有一定差異；(3)該技術(shù)是在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行靶向識(shí)別并切割，故存在脫靶效應(yīng)。

盡管如此，該技術(shù)在眼科各類(lèi)疾病治療中具有很大的應(yīng)用前景，通過(guò)全方面探索眼科疾病相關(guān)基因并構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)驗(yàn)證其生物學(xué)過(guò)程，將“基因功能探索”與“目的基因編輯”相結(jié)合，有助于進(jìn)一步的新藥研發(fā)、耐藥性分析等，將進(jìn)一步促進(jìn)基因治療在眼科疾病中的有效應(yīng)用。