吳 姍， 虞惠貞， 沈旭芳， 孫 超， 張 荃， 陳 哲， 尹文秀， 張明哲， 張曉峰

(杭州海關技術中心， 浙江 杭州 310016)

海參不僅是珍貴的食品，也是名貴的藥材，在中國、日本、韓國、印度尼西亞等亞洲國家深受消費者喜愛。全球有海參1 400余種，分別屬于6個目25個科，可供食用的海參約40多種[1]。暗色刺參(Isostichopusfuscus)屬棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirotida)刺參科(Stichopo-didae)，產于加拉帕戈斯群島一帶，墨西哥、巴拿馬、秘魯和厄瓜多爾是其主要出產國。暗色刺參是刺參中的珍品，也是被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)目錄的物種[2]，但受到經濟利益驅使，市場上暗色刺參的銷售并未絕跡。

對瀕危動植物的精準鑒別是開展瀕危物種保護的最基本手段。傳統(tǒng)的海參鑒別方法主要依賴海參的外部形態(tài)和解剖特征，如Toral[3]認為，鑒定完整形態(tài)的暗色刺參時，其鈣質骨針(Calcareous spicules)的特征優(yōu)于庫維管(Cuvierian tubules)和鈣質環(huán)(Calcareous ring)的形態(tài)特征，是一種較可靠的分類依據(jù)。但基于形態(tài)學的鑒定需要鑒定人經驗豐富，在海參銷售時，海參往往被加工成干海參、鹽漬海參、即食海參、凍干海參、海參膠囊及海參口服液等，形態(tài)已經不完整，單純從其形態(tài)上難以鑒別。

現(xiàn)代分子生物學的鑒別方法可有效克服上述形態(tài)學鑒定方法的不足，同時也比物理學的光譜結構分析法和化學的內含物質結構分析法更穩(wěn)定可靠。律迎春等[4]基于線粒體細胞色素C氧化酶亞基 Ⅰ(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ gene，CO Ⅰ)的序列特異性，通過斑點雜交方法鑒定了4種海參種類。此外，律迎春[5]又開發(fā)了PCR-RFLP方法并對梅花參(Thelenotaananas)、仿刺參(Apostichopusjaponicus)、加州擬刺參(Parastichopuscalifornicus)和北大西洋瓜參(Cucumariafrondosa)進行了鑒定。和律迎春的基于CO Ⅰ的序列特異性不同，Wen等[6]基于線粒體16S rRNA(16S ribosomal RNA)基因序列，也建立了PCR-RFLP的方法，對6種刺參科的海參進行了物種鑒定。但不論是斑點雜交，還是PCR-RFLP的方法，律迎春[5]認為PCR方法的準確率更高，可達到100%。Wen等[7]采用species-specific PCR的方法對市售的11種深加工海參進行鑒定，通過特異性引物的設計，對11種海參的16S rRNA進行了擴增，并得到了較準確的鑒定結果。Zuo等[8]則采用multiplex-PCR對仿刺參、加州擬刺參、梅花參等海參進行了鑒定。目前，利用分子生物學對海參種類進行鑒定的標準僅局限于仿刺參，包括DB21/T 2138—2013仿刺參基因識別檢測方法[9]和DB37/T 2292—2013刺參(種質)[10]，前者制定了仿刺參的熒光PCR的鑒定方法，后者利用微衛(wèi)星定點分析進行物種鑒定。

進行瀕危動物保護時，常關注的是哺乳動物、鳥類或鯨、鯊體型較大的海洋動物等，海參作為一種體型較小、較為低等的動物，受到的關注有限，因此目前尚未有利用分子生物學手段鑒定暗色刺參的報道。本研究基于暗色刺參物種特異性的核酸片段，設計了引物和探針，建立了能夠精準鑒定暗色刺參的實時熒光PCR方法。與利用通用引物的非特異性分子鑒定方法(如DNA Barcoding方法)相比，本方法更簡單、準確，適合在混合物中鑒定是否存在暗色刺參。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于實驗的海參種類見表1。此外用于暗色刺參引物探針特異性驗證的物種還包括：中國槍烏賊(Loligochinensis)、歐洲鰻(Anguillaanguilla)、大西洋鮭(Salmosalar)、大西洋鱈(Gadusmorhua)，上述材料均購自市場。

表1 用于檢測的海參物種Table 1 Sea cucumber species for study

1.2 DNA抽提及濃度測定

1.2.1 樣品前處理 干海參：取10 g用水泡發(fā)，取泡發(fā)后的海參2 g，用振蕩研磨儀(Bertin Precellys Evolution, Bertin Technologies, 法國)研磨成細末，研磨程序為：5 500 r/min，20 s，并重復4～6次。即食海參：取2 g直接用振蕩研磨儀研磨成細末，程序同上。

1.2.2 DNA抽提 采用QIAGEN食品提取試劑盒(DNeasy nericon Food Kit)，取樣量為200 mg，加入DNA提取裂解液1 mL使研磨后的海參降解成液狀，繼續(xù)按照說明書進行DNA抽提，將抽提得到的DNA溶解在50 μL的水中，測定DNA濃度。

1.2.3 DNA濃度、純度測定 使用NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, 美國)測260和280 nm處的吸光值A260和A280，其中吸光值A260可換算成DNA濃度，用A260/A280比值表示DNA純度。

1.3 暗色刺參樣品的測序和BLAST比對

將購買的標識為“暗色刺參”的樣品進行PCR擴增和測序，并進行BLAST比對。PCR擴增的方法見表2中參考文獻[5,11-12]，測序由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成，得到的序列詳見圖1，序列進行BLAST比對的結果見表2。

表2 暗色刺參樣本PCR擴增產物的序列比對Table 2 Sequence alignment of PCR products from I. fuscus sample

( (a), (b)和(c)： 分別對應表2中的序列1、序列2和序列3。 (a), (b) and (c): Corresponding to sequence 1, sequence 2 and sequence 3, respectively, in table 2.)

1.4 暗色刺參特異性引物設計

在GenBank上收集暗色刺參和相關刺參科及其他近似物種的線粒體基因(見表3)。使用MegAlign軟件對表3中所列的COⅠ和16S rRNA序列分別進行比對，找到與其他海參序列差異較大的區(qū)域(見圖2)，設計暗色刺參特異性引物和探針(見表4)。同時，根據(jù)1.3中測序得到的暗色刺參的序列(見圖1)，設計暗色刺參特異性引物和探針(見表4)。

表3 用于引物探針設計的基因/基因組序列Table 3 Gene /Genome sequences (GenBank numbers) for primer and probe design

((a), (b)和(c): 分別為I-fu-1的上游引物, 探針和下游引物的設計區(qū)域。 (d), (e)和(f): 分別為I-fu-2的上游引物, 探針和下游引物設計區(qū)域。 方框表示對應的引物或探針序列的全部或者部分(圖(d)和(f)只顯示了部分的序列)。圖中標黑的堿基表示和大多數(shù)序列中的堿基有差異。 (a), (b) and (c): Regions for design forward primer, probe and reverse primer of I-fu-1; (d), (e) and (f): Regions for design forward primer, probe and reverse primer of I-fu-2. The box in the figure indicates all or part of the corresponding primer or probe sequence ( (d) and (f) only show part of the sequences). Residues marked black were different from the majority.)

表4 引物探針序列Table 4 sequence for primer and probe

1.5 實時熒光PCR反應

實時熒光PCR反應體系如下：10 μL Premix Ex Taq(Takara，中國)，上游引物(0.01 μmol/L)0.4 μL，下游引物(0.01 μmol/L)0.4 μL，探針(0.01 μmol/L)0.4 μL，取上述DNA 2 μL，用水補足體積至20 μL。應用熒光定量PCR儀lightcycle 480(Roche，美國)進行反應，反應程序為:(1) 95 ℃，10 s。(2) 95 ℃，5 s；60 ℃，23 s；40個循環(huán)。反應結束后采用儀器程序自帶的“Abs Quant/Fit Points for All Samples”方法計算Ct(Ct表示每個反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù))值。每個反應重復3次，本研究中所顯示的Ct值是重復3次的平均值，SD為標準差。

為檢驗抽提得到的海參、烏賊、魚類等物種的DNA質量，參照國家標準GB/T25165—2010[13]，制備檢測真核生物的引物探針組合18S rRNA，通過該熒光PCR反應得到Ct值，該Ct值可表示對應的DNA質量。熒光PCR反應條件，及引物和探針序列參照標準GB/T25165-2010[13]。

1.6 標準曲線繪制

為確定熒光PCR檢測體系的檢出限和線性范圍，對目標DNA進行梯度稀釋，并利用DNA濃度和Ct值之間的相關性繪制標準曲線。將抽提得到的DNA進行4倍梯度稀釋，進行熒光PCR檢測。變量相關性公式[14]：Ct值=blog10[DNA濃度]+a，其中l(wèi)og是對數(shù)函數(shù)符號；b是斜率；a是截距。

1.7 深加工不同種海參混合樣中暗色刺參的檢測

1.7.1 深加工混合樣的制備及混合物的DNA提取 以暗色刺參、墨西哥刺參和梅花參為材料，制備深加工混合樣。將海參用冷水浸泡12 h，再沸水燉煮20 min。將燉煮后的海參按照表5的比例混合，每個混合樣總質量10 g，共制成7個樣。按照比例混合后的10 g樣品經過震蕩研磨儀(型號同1.2)充分混合研磨成細末(反應程序同1.2)，加入DNA提取裂解液(DNeasy nericon Food Kit，QIAGEN)15 mL，使10 g混合物完全降解成液狀，取降解后液體混合物1 mL，繼續(xù)進行DNA抽提，并測定DNA濃度和純度(方法同1.2)。

表5 3種深加工海參混合制品中暗色刺參的檢測結果Table 5 Detection of I. fuscus in the mixed sample of three processed sea cucumbers

1.7.2 熒光PCR檢測 根據(jù)1.5和1.6中不同引物探針的特異性、靈敏度的檢測結果，采用最佳的引物探針組合I-fu-4進行檢測，檢測方法同1.5。每個濃度的樣品重復檢測3次，3次結果中2次的Ct值小于等于37即為陽性，否則為陰性。以“+”表示能檢測到該百分含量的暗色刺參，以“—”表示不能檢測到該百分含量的暗色刺參。

2 結果

2.1 引物探針的特異性驗證

在GenBank上收集了暗色刺參和相關刺參科及其他近似物種的線粒體基因。如表3所示，只有少數(shù)海參，如Stichopusludwigi、Cucumariaminiata和Parastichopusnigripunctatus等具有完整的線粒體基因組信息，而多數(shù)海參只收集到線粒體中16S rRNA和COⅠ基因的信息。將表3中16S rRNA基因的序列進行排序比對，發(fā)現(xiàn)表3中海參之間的16S rRNA序列差異巨大，這可能是收集得到的序列不完整，長度差異大，從而導致序列比對有巨大差異，因此，未能在16S rRNA基因上找到適合設計引物探針的區(qū)域。通過比對COⅠ基因的序列，在圖2所示的區(qū)域設計了具有暗色刺參物種特異性的引物探針組合I-fu-1和I-fu-2(見表4)。根據(jù)測序得到的序列1、2和3設計了相應的引物探針組合I-fu-3、I-fu-4、I-fu-5和I-fu-6(見表4)。

使用6組引物探針組合對20個樣本(含陰性對照樣本)進行檢測，結果如表6所示。I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4、I-fu-6的特異性較高，只在目標物種中得到陽性結果；I-fu-2和I-fu-5除了在暗色刺參中出現(xiàn)陽性結果，在同一屬的墨西哥刺參中也得到了陽性結果。和I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4比較，I-fu-6的檢測效率不高，檢測相同濃度的暗色刺參DNA，其余引物探針得到的Ct值在20～22之間，但I-fu-6的Ct值在28左右。因此在后續(xù)的靈敏度驗證中只對I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4這3組引物探針進行靈敏度驗證。

表6并未完整列出20個樣品的檢測結果，而只列出了特異性引物(I-fu-1～I-fu-6)反應有陽性結果的樣品，其余檢測結果為陰性(低于檢測限)的樣品為：表1中的其他海參樣品，中國槍烏賊、歐洲鰻、大西洋鮭和大西洋鱈樣品，用于陰性對照的ddH2O。上述未列入表6的驗證樣品，用真核生物通用引物探針組合(18S rRNA)擴增其DNA，除ddH2O外均得到陽性結果，且Ct值在18～23之間，說明樣品的DNA適合用于熒光PCR的擴增。

表6 暗色刺參引物探針的特異性驗證Table 6 Specificity of primer and probe for detection of I. fuscus

2.2 引物探針的靈敏度驗證

引物探針的檢測靈敏度，即指在一次熒光PCR反應中能夠檢測到暗色刺參的最低濃度，且DNA樣本中不包含其他物種的DNA。表7顯示I-fu-3和I-fu-4的靈敏度優(yōu)于I-fu-1，就real-time PCR擴增曲線的圖形顯示(圖略)，I-fu-4的陽性曲線顯示的熒光值較高，陽性較強。比較了3組檢測體系的檢出限和線性范圍，進一步比較I-fu-1、I-fu-3和I-fu-4引物探針組合的優(yōu)劣。I-fu-1能檢測到的最低濃度為0.003 ng/μL，以此濃度為低限，繪制得到的標準曲線的R2值大于0.99(y=-4.074 6x+25.751，R2=0.997 9)，說明在此檢測濃度范圍內(40.0～0.003 ng/μL)，檢測得到的Ct值和DNA濃度相關性較大，I-fu-1的檢測靈敏度為0.003 ng/μL左右。表7顯示，I-fu-3和I-fu-4的最低檢測濃度是0.000 8 ng/μL，同樣以此濃度為低限，得到標準曲線的R2值分別為0.984 8(y=-3.813 1x+24.104)和0.996 2(y=-4.182 2x+23.116)，說明在40.0～0.000 8 ng/μL的檢測濃度范圍內，I-fu-4得到的Ct值更可信，與DNA濃度的相關性更高。因此，就檢測靈敏度而言I-fu-4優(yōu)于I-fu-1和I-fu-3，可以達到0.000 8 ng/μL。

表7 暗色刺參引物探針的靈敏度驗證Table 7 Sensitivity of primer and probe for detection of I. fuscus

2.3 不同種海參深加工混合樣品中的檢測靈敏度

用墨西哥刺參、梅花參和暗色刺參制備了9個不同含量比例的混合樣品(見表5)，樣品1～8都含有目標物種暗色刺參，樣品9為只含有墨西哥刺參和梅花參的陰性對照。檢測結果的Ct值一方面受到目標海參百分含量的影響，另一方面和抽提得到DNA的濃度、純度有關。表5所示，所提取的DNA濃度都在45 ng/μL左右(9個樣品的純度A260/A280在1.90～2.1之間，具體結果略)，只有樣品7濃度較高，達到61.9 ng/μL，而樣品2濃度較低，為20.9 ng/μL，這也導致了含暗色刺參百分含量更高的樣品2(含量為10%)與百分含量低一半的樣品3(含量為5%)檢測得到的Ct值相近。但總體趨勢是，目標物種含量高，檢測結果Ct值較低，隨著目標物種含量的降低，Ct值升高，且樣品1～8中目標物種的檢測結果皆為陽性。通過計算得到暗色刺參含量最低的樣品8(含量為0.05%)中暗色刺參的DNA濃度為0.024 ng/μL(48.7×0.05%=0.024)，此時檢測得到的Ct值為33左右(見表5)，與表7中濃度相仿的樣品(0.01 ng/μL)相比Ct值(31.4±0.7)略升高，說明在檢測海參混合樣品時，檢測靈敏度較檢測單純樣品時有所降低。

3 討論

在動物研究領域，線粒體基因可以作為理想的分子標記用于種質鑒定，其中COⅠ、COⅡ、12S rRNA和16S rRNA基因是應用頻率最高的一組分子標記[15-17]。在棘皮動物中，COⅠ和16S rRNA基因更是被廣泛應用于種群分類鑒定和系統(tǒng)進化研究[18-19]。收集了暗色刺參及其近似種海參的16S rRNA和COⅠ基因，但序列比對后發(fā)現(xiàn)16S rRNA的序列長度不一，序列間差異極大，因此較難設計合適的引物探針。比較而言，在海參中COⅠ基因信息較全，種和種之間差異也較明顯，適合于設計暗色刺參特異性引物探針，如本研究中的I-fu-1和I-fu-2。同時本研究又根據(jù)暗色刺參測序得到的序列設計了引物探針組合I-fu-3、I-fu-4、I-fu-5和I-fu-6。比較各引物探針組合的特異性和靈敏度，認為引物探針組合I-fu-4的結果最佳，特別在靈敏度上明顯優(yōu)于特異性同樣優(yōu)異的I-fu-1，而I-fu-4和I-fu-1的差異僅存在于I-fu-4的下游引物中較I-fu-1少一個堿基C，同時I-fu-1探針中一個堿基G在I-fu-4中被替換成堿基A。I-fu-1根據(jù)GenBank中序列(AF486424.1、AF486425.1和AF486429.1，圖2(a)—(c))設計得到，I-fu-4則根據(jù)暗色刺參樣品的測序結果設計得到，這兩個序列產生差異的原因，可能是測序的誤差，也可能是樣品序列本身變異。但測序重復3次得到的結果一致，同時實驗結果顯示I-fu-4的引物探針組合較I-fu-1具有更高的檢測靈敏度，因此較傾向是樣本序列的變異。這是否會導致在用I-fu-4檢測序列和AF486424.1、AF486425.1、AF486429.1等一致的暗色刺參樣本時出現(xiàn)假陰性？但因為本研究實際沒有購買到COⅠ序列和AF486424.1一致的暗色刺參樣本，因此并未能進行驗證。但本研究用I-fu-1檢測序列不一致的暗色刺參樣本時，檢測結果也并未出現(xiàn)假陰性，由此推測，用I-fu-4檢測COⅠ序列和AF486424.1等一致的暗色刺參樣本時，出現(xiàn)假陰性的可能性較低。此外，我們將I-fu-1和I-fu-4兩組引物探針進行1∶1混合后對現(xiàn)有的樣本進行特異性和靈敏度檢測，結果顯示特異性不受影響，只在目標物種中檢測到陽性(結果略)，靈敏度和I-fu-4的結果相近，最低能檢測到0.000 8 ng/μL濃度的樣品(見表7)，雖然此濃度下對應的Ct值為38左右，但顯示的R2為0.994 9(y=-4.206 1x+24.801)，說明該Ct值仍較為可信，能較準確反應DNA的濃度，因此為了防范因引物不匹配而造成的假陰性，可采用I-fu-1和I-fu-4兩組引物探針進行1∶1混合的方法進行檢測。

對3種混合海參樣本的檢測結果表明，本方法同樣適用于混合物中目標物種暗色刺參的檢測。在混合樣本中，摻入的是和暗色刺參同一屬的墨西哥刺參以及不同屬的梅花參，一般而言混合樣本中，物種間的遺傳距離越近，則對目標物種的檢測干擾越大。如作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，在黃牛、水牛和牦牛的混合肉樣中檢測黃牛，比在黃牛、豬、羊的混合肉樣中檢測黃牛的檢測靈敏度會降低很多[20]。在混合物檢測的結果中(見表5)，即便在墨西哥刺參含量高達99.9%，暗色刺參含量低至0.05%混合樣中也成功檢測到了目標物種暗色刺參。同時，研究中并未再制備暗色刺參含量更低的混合樣本，是認為更低的含量在實際樣本中存在的可能性很小，沒有實際檢測的意義，本方法的靈敏度以及特異性能夠滿足日常鑒定檢測需求。

本文的檢測方法是基于暗色刺參特有的DNA序列設計的，因而即便混合物中暗色刺參含量低至0.05%也能成功檢出，相比較而言，使用通用引物(如DNA條形碼) 檢測的方法則不適用于在多種混合物中鑒定含量較低的目標物種[21-22]。本方法和律迎春等[4-5]開發(fā)的斑點雜交法和PCR-RFLP鑒定海參的方法相比較，省卻了雜交、酶切等步驟；和Wen等[7]采用的species-specific PCR方法以及Zuo等[8]采用的multiplex-PCR方法相比較，省卻了電泳跑膠的步驟，與上述方法相比本方法較簡單、高效、易操作。

4 結語

對瀕危動植物的鑒定是對瀕危動植物保護的重要環(huán)節(jié)，本文探討了被列入CITES目錄的保護動物—暗色刺參的熒光PCR鑒定方法。經驗證，基于暗色刺參線粒體的COⅠ基因設計的熒光PCR引物和探針具有高特異性和高靈敏度的特性，本方法適用于在混合樣本中檢測暗色刺參。使用本方法可快速、精準的鑒定暗色刺參,這將有利于該物種的保護工作。