徐方飚， 趙 哲， 謝 抗， 王新志

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000；2.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

再灌注損傷存在于心腦血管、肝腎臟、子宮移植等疾病變化過(guò)程中[1-4]，是缺血后恢復(fù)血流，使得相關(guān)組織細(xì)胞在再灌注過(guò)程中進(jìn)一步受到的損傷[5]。在心血管疾病中，由于再灌注后改變了血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得血管消除阻塞后仍不能完全實(shí)現(xiàn)組織血液灌注，嚴(yán)重時(shí)可表現(xiàn)為心肌功能障礙、血流微循環(huán)障礙等危及生命的病理現(xiàn)象。在腦缺血再灌注中，大量免疫細(xì)胞會(huì)在損傷部位聚集，并在短時(shí)間內(nèi)大量釋放細(xì)胞分裂素和氧自由基等物質(zhì)，能夠直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，從而造成內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的損傷[6]，肝臟中再灌注損傷病理機(jī)制根據(jù)目前研究主要在無(wú)氧代謝、氧化應(yīng)激等方面[7]，腎臟中病理機(jī)制如內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)等[8]。中藥對(duì)于減輕缺血再灌注損傷是全面的，含括減少自由基、控制炎癥反應(yīng)等等多方面[9-10]。

中藥在再灌注損傷中的病理機(jī)制已有一定的基礎(chǔ)，涉及通路[11]、抗氧化、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]、藥代動(dòng)力學(xué)[13]等方面。本研究旨在通過(guò)現(xiàn)有知識(shí)結(jié)構(gòu)及數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建缺血再灌注損傷機(jī)制核心靶點(diǎn)與中藥成分及中藥的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，利用數(shù)學(xué)思維幫助基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床上中藥選擇，補(bǔ)充中醫(yī)基礎(chǔ)理論的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證據(jù)以及開(kāi)拓新藥研發(fā)思路。

1 材料與方法

1.1 再灌注損傷靶點(diǎn)獲取 通過(guò)檢索文本挖掘數(shù)據(jù)庫(kù)、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)，以“reperfusion injury”為檢索詞，獲取再灌注損傷相關(guān)靶點(diǎn)，并作取交集處理，作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。取交集的做法能夠一定程度的緩解不同數(shù)據(jù)庫(kù)信息不對(duì)等的狀況，并對(duì)獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)nipot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)由Gene symbol轉(zhuǎn)換成蛋白名稱。

1.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及篩選核心靶點(diǎn) 將關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)中，蛋白種類設(shè)置為智人(Homosapiens)，證據(jù)評(píng)分(minimum required interaction score)選取最高評(píng)分0.9分，獲取蛋白相互作用關(guān)系。將獲取的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI)輸入Cytoscape 3.7.2軟件中可視化呈現(xiàn)及拓?fù)浞治龊螳@取核心靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“化合物-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，收集與核心靶點(diǎn)相關(guān)的化合物，并以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18篩選化合物后[14-16]，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建“化合物-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)保存化合物對(duì)應(yīng)中藥及化合物分子結(jié)構(gòu)。

1.4 構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge插件融合“核心靶點(diǎn)-化合物”和“化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)，最終可視化“核心靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 核心靶點(diǎn)與化合物對(duì)接驗(yàn)證 在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中檢索并下載核心靶點(diǎn)3D結(jié)構(gòu)，利用Autodock 4.2.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接，進(jìn)一步評(píng)估核心靶點(diǎn)與化合物之間的聯(lián)系[17]。

1.6 數(shù)據(jù)挖掘 參照“十二五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[18]及2020年版《中國(guó)藥典》，獲取核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)中藥的性味歸經(jīng)，利用Origin 2019b繪圖軟件繪制柱狀圖、散點(diǎn)圖和條形圖。

2 結(jié)果

2.1 再灌注損傷靶點(diǎn)篩選 經(jīng)過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)和Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、比對(duì)后，共獲得85個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 為了明確85個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中的核心靶點(diǎn)，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件可視化后利用Cytohubba 0.1插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以獲取度值不小于中位數(shù)2倍，即度值不小于18的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。共獲得6個(gè)核心靶點(diǎn)，按度值從大到小依次為STAT3(度值26)、JUN(度值24)、TNF(度值24)、RELA(度值19)、IL1B(度值19)、IL6(度值18)，見(jiàn)圖2。圖中關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)黃色節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)顏色越紅則靶點(diǎn)度值越高。

2.3 “化合物-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的全面檢索，共得到41個(gè)經(jīng)口服利用度和類藥性篩選后的化合物與6個(gè)核心靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，將對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“化合物-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。圖中核心靶點(diǎn)為菱形，化合物為六邊形節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)大小以該節(jié)點(diǎn)度值為標(biāo)準(zhǔn)，即度值越大，節(jié)點(diǎn)越大。

2.4 構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò) 為了更好的了解中藥與成分與靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。由于中藥數(shù)量較大，不便于觀察，節(jié)選中藥度值不小于4的中藥進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。6個(gè)靶點(diǎn)度值代表所對(duì)應(yīng)的成分個(gè)數(shù)，依次為轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA，度值26)、腫瘤壞死因子(TNF，度值19)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN，度值14)、白介素6(IL6，度值12)、白介素1β(IL1B，度值7)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3，度值4)。度值排名前5的成分為β-谷甾醇(MOL000358，度值246)、槲皮素(MOL000098，度值193)、山柰酚(MOL000422，度值136)、木犀草素(MOL000006，度值97)、異鼠李素(MOL000354，度值41)，41個(gè)化合物信息見(jiàn)表1。中藥度值不小于5的有45個(gè)，條形圖見(jiàn)圖5。

表1 化合物信息及度值

2.5 分子對(duì)接結(jié)果 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取41個(gè)成分結(jié)構(gòu)，利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取STAT3、TNF、JUN、IL1B、RELA、IL6分子結(jié)構(gòu)，pymol 2.3.1去除水分子和自身配體，AutoDockTools-1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接。小分子化合物與蛋白之間相互作用的強(qiáng)度可用結(jié)合力(Affinity)表示，Affinity值越低，結(jié)合力越強(qiáng)[19]。若結(jié)合力<0 kcal/mol，表明配體分子能與受體蛋白進(jìn)行自發(fā)的結(jié)合[20]。結(jié)合力熱圖見(jiàn)圖6，圖中顏色越紅則結(jié)合力越強(qiáng)。聚類歸整后，STAT3與41個(gè)成分整體結(jié)合力較高，IL1B與RELA較為相似，IL6與TNF較為相似，故這兩組聚類在一起，JUN則整體最低。為了更好地展現(xiàn)各靶點(diǎn)分子結(jié)構(gòu)，在這6個(gè)靶點(diǎn)中選取各自結(jié)合力最強(qiáng)的，展示其結(jié)合構(gòu)象的2D與3D展示圖像，見(jiàn)圖7。構(gòu)象2D圖中，鏈接的紅色虛線為疏水作用，綠色虛線氫鍵作用，字母代表結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸，氫鍵作用力與氨基酸殘基之間的疏水作用力是結(jié)合穩(wěn)定的主要存在。

2.6 中藥性味歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計(jì) 共收集381味中藥，大部分中藥均有入肝經(jīng)的功效，苦、寒藥居多，見(jiàn)圖8～9。中醫(yī)在治療時(shí)的理念是整體論治，而本研究對(duì)象為再灌注損傷，其可以出現(xiàn)在全身多個(gè)部位，同時(shí)本次統(tǒng)計(jì)結(jié)果包含所有十二正經(jīng)，符合疾病本身病理特性，符合中醫(yī)整體論治的理念。歸三焦經(jīng)的兩味中藥分別是香附與梔子，同時(shí)，這2味中藥的度值分別為5、3，成分中與香附有聯(lián)系的為MOL000006、MOL000098、MOL000354、MOL000358、MOL000422，與梔子有聯(lián)系的為MOL000098、MOL000358、MOL000422。所含成分根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)可調(diào)控除STAT3外的5個(gè)核心靶點(diǎn)，但通過(guò)分子對(duì)接顯示，它們與STAT3靶點(diǎn)的結(jié)合力較好，不排除結(jié)合的可能性，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 討論

再灌注損傷可以發(fā)生在全身各個(gè)臟器中，造成的連鎖反應(yīng)給予疾病恢復(fù)等各方面一定程度的打擊。目前，對(duì)于再灌注損傷的機(jī)制研究趨于完善，治療上受限于發(fā)病機(jī)制較多，結(jié)合患者個(gè)人體質(zhì)原因復(fù)雜，西藥的單一成分、單靶點(diǎn)及常規(guī)輸液治療方式起到的治療效果有限。中藥中成分多，多靶點(diǎn)多通路，同時(shí)對(duì)多種發(fā)病機(jī)制的共同干預(yù)，治療方式以口服湯藥為主要，并且已有一定的臨床療效及病理基礎(chǔ)研究[21-22]。本研究通過(guò)符合中藥多靶點(diǎn)多機(jī)制干預(yù)特性的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建靶點(diǎn)到中藥成分之間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過(guò)分析統(tǒng)計(jì)后，總結(jié)出中藥在減少再灌注損傷的用藥規(guī)律。

白果、菊花、葫蘆巴、木蝴蝶和山豆根調(diào)控多個(gè)再灌注損傷的核心靶點(diǎn)。現(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)于白果，既銀杏成熟種子的基礎(chǔ)研究較多，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中研究與應(yīng)用較多，能夠促進(jìn)腦部供血，改善癡呆患者學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)能夠減少腦組織損傷，保護(hù)神經(jīng)功能[23]。菊花中多成分[24]、多部位[25]均具有抗氧化作用，張永利等[26]發(fā)現(xiàn)，在抗視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的兔模型中，菊花通過(guò)影響SOD、MDA活性，從而達(dá)到減少再灌注損傷的功效。就成分而言，多成分已發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用，如槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素[27-30]。

本研究對(duì)6個(gè)核心靶點(diǎn)及41種成分進(jìn)行高通量的分子對(duì)接模擬，結(jié)合能熱圖顯示，它們均有良好對(duì)接，并且達(dá)到具有一定的結(jié)合活性標(biāo)準(zhǔn)。其中STAT3與41種成分整體對(duì)接活性較高，但目前關(guān)于此靶點(diǎn)的中藥作用機(jī)制研究較少，TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有4種成分、8味中藥證實(shí)能夠調(diào)節(jié)此靶點(diǎn)，同時(shí)STAT3是PPI網(wǎng)絡(luò)中度值最高的靶點(diǎn)，提示其可作為潛在有效的治療靶點(diǎn)。STAT3在心臟、大腦、胎盤(pán)、肺、肝、骨骼肌、腎臟和胰腺均有表達(dá)，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，能夠介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)白介素和一些列生長(zhǎng)因子的反應(yīng)[31]。JUN與41種成分結(jié)合整體偏低，考慮與JUN自身蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)，其蛋白結(jié)構(gòu)是長(zhǎng)條型蛋白，空間交錯(cuò)較少，這意味著與小分子的結(jié)合均在蛋白結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合。結(jié)合力熱圖中，花生四烯酸與6個(gè)核心靶點(diǎn)結(jié)合力均處于勉強(qiáng)能夠結(jié)合的狀態(tài)，與自身復(fù)雜結(jié)構(gòu)一定關(guān)系?；ㄉ南┧峥烧{(diào)節(jié)多種炎癥因子表達(dá)，同時(shí)其代謝通路亦影響多種炎性因子水平[32]。任越等[33]利用藥效團(tuán)模型，基于花生四烯酸代謝通路匹配出適合應(yīng)用于抑制炎癥風(fēng)暴的藥物，與本研究中的成分多數(shù)重合。

中醫(yī)認(rèn)為肝藏血，再灌注損傷相關(guān)中藥歸肝經(jīng)居多，基于此，本研究認(rèn)為藥物代謝與這中間具有一定的聯(lián)系。目前有研究表明，藥物代謝與肝藥酶有關(guān)，亦可從此角度來(lái)探討中藥歸經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)中藥亦涉及肺經(jīng)，肺主治節(jié)，朝百脈，具有宣發(fā)和肅降的作用。肝與肺均對(duì)全身氣血運(yùn)行起到重要調(diào)節(jié)作用，再灌注損傷發(fā)生的場(chǎng)所大多處于脈內(nèi)，氣攝血于脈內(nèi)，肝臟與肺是人體氣機(jī)，提示再灌注損傷中的物質(zhì)基礎(chǔ)與中醫(yī)中氣概念的存在一定的聯(lián)系。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，以再灌注損傷相關(guān)靶點(diǎn)作為出發(fā)點(diǎn)，探尋中藥減少再灌注損傷的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)及一般應(yīng)用規(guī)律，為中醫(yī)理論現(xiàn)代化研究提供了新的切入點(diǎn)，也為進(jìn)一步基礎(chǔ)研究深入開(kāi)發(fā)可減少再灌注損傷的天然制劑提供思路，還可為中西醫(yī)結(jié)合治療再灌注損傷的用藥提供借鑒。