烏木提·巴合提別克，李亞偉，佟鑫宇，朱麗穎，鄒莉

（東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

桑黃Sanghuangporus spp.是一種珍稀大型藥用真菌[1]。據(jù)文獻資料報道，桑黃具有抗氧化、抗病毒、降血壓和抗腫瘤等多種藥效[2]，其藥效來源于桑黃含有的活性成分，其中多糖和萜類是主要的藥效成分[3]。

暴馬桑黃S.baumii是生長在暴馬丁香樹上的一種桑黃。目前，關于暴馬桑黃的研究主要集中在暴馬桑黃的藥理作用方面，人們逐漸認識到暴馬桑黃是抗癌效果最好的藥用菌之一，但是由于市場需求量大，加上人們不斷地采摘，同時還不能大量人工栽培，使得暴馬桑黃資源匱乏，這嚴重限制了其發(fā)揮藥理作用。因此通過外源因子誘導暴馬桑黃倍半萜合成途徑中的關鍵基因來促進倍半萜合成，將是一種可靠的技術手段。

倍半萜是暴馬桑黃次生代謝物，具有很好的抗炎、抗寄生蟲和抗癌活性[4]。倍半萜合酶作為倍半萜生物合成途徑的關鍵酶，負責把法尼焦磷酸環(huán)化為多個具有不同生物活性的結(jié)構(gòu)多樣的化合物，主要負責催化法尼基二磷酸（FPP）的釋放，然后引導碳正離子沿著異戊烯鏈遷移，進而誘導一系列環(huán)化和重排反應，暴馬桑黃倍半萜合成代謝途徑如圖1。目前，青蒿等幾種植物中對倍半萜合酶的研究已經(jīng)取得了一些進展[5-6]，但在真菌中的研究相對較少，僅在灰蓋鬼傘、靈芝、紫芝、牛樟芝等[7-10]少數(shù)真菌中有所報道。

圖1 暴馬桑黃倍半萜合成途徑（MVA 途徑）Fig.1 Biosynthesis pathway of sesquiterpenes in S.baumii (MVA pathway)

茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）作為次生代謝途徑中重要的信號轉(zhuǎn)導分子，可激活或抑制相應轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進而調(diào)控與植物次生代謝相關的關鍵酶基因的表達，影響酶的活性，最終調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成[11-12]。研究表明，MeJA 可以誘導植物中倍半萜類物質(zhì)的生物合成。徐艷紅等[13]外施MeJA 處理白木香樹發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生3 種倍半萜物質(zhì)。蘇閃閃[14]用MeJA 對洋甘菊葉片進行處理后，MrβFS（一種倍半萜合成相關基因）表達量增加。其中，在處理24 h后Mr-βFS表達水平是對照組的11.5 倍。GC—MS 分析表明，MeJA 誘導后葉片中幾種揮發(fā)性萜類物質(zhì)含量與對照相比均存在顯著差異。鄧文靜等[15]研究MeJA 對廣藿香JA 信號轉(zhuǎn)導途徑及倍半萜合成途徑關鍵基因表達的影響發(fā)現(xiàn)，JAZ2是JA 信號轉(zhuǎn)導途徑里響應MeJA 誘導的主要基因，可激活倍半萜合成途徑FPPS基因的協(xié)同表達，進而影響廣藿香醇等倍半萜的合成。而MeJA 誘導真菌倍半萜類物質(zhì)合成的研究相對較少。張國權(quán)[16]用MeJA 對鮑姆纖孔菌進行誘導，提高了Unigene1790等倍半萜合酶基因的表達量。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與載體

本試驗所用的暴馬桑黃菌種經(jīng)ITS（Internal transcribed spacer）鑒定為暴馬桑黃（NCBI 登錄號為KP974834），命名為暴馬桑黃DL101，于東北林業(yè)大學森林保護學科實驗室保藏。大腸桿菌Escherichia coli克隆菌株Top10、表達菌株BL21（DE3）和載體pMD18-T vector 購自大連Takara生物公司。

1.2 試驗試劑

Premix Taq 酶、TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）、Prime Script Ⅱ1ST、Strand cDNA Synthesis Kit 和Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 均購于大連Takara 公司。植物總RNA 提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒均購于北京天根生化公司。MeJA 購自Sigma 公司。其余所用藥物為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗引物

用于SbTps2基因克隆、啟動子克隆、檢測、熒光定量的引物序列如表1 所示。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 SbTps2 基因克隆

用植物總RNA 提取試劑盒提取暴馬桑黃總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，SbTps2-F1、SbTps2-R1為引物進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒進行純化回收，并檢測回收產(chǎn)物濃度?；厥债a(chǎn)物送至哈爾濱擎科生物公司測序。

1.5 SbTps2 基因啟動子克隆

用DNA 提取試劑盒提取暴馬桑黃基因組DNA，以得到的DNA 為模板，以SbTps2-pro-F2、SbTps2-pro-R2為引物進行PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒進行純化回收，核酸分析儀檢測回收產(chǎn)物濃度。

1.6 SbTps2 基因與啟動子序列生物信息學分析

將序列提交至NCBI，用Open reading frame，ORF 預測SbTps2基因開放閱讀框；再用NCBI里 的Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）預測SbTps2 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；用在線軟件http://gsds.gao-lab.org/ 對基因DNA 序列進行內(nèi)含子、外顯子分布分析。分別用在線軟件ProtParam、TMHMM、SignalP-3.0、SOPMA、SWISS-MODEL 預測蛋白理化特性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、蛋白二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。用Plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測啟動子結(jié)構(gòu)，并用在線軟件http://gsds.gao-lab.org/制圖。用MEGA 5.2進行系統(tǒng)發(fā)育預測和分析[18-20]。

1.7 MeJA對SbTps2 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

用PD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)暴馬桑黃菌絲體，在搖菌培養(yǎng)14 d 后，勻質(zhì)儀打碎，以4%（V/V）接種量接入250 mL PD 培養(yǎng)基中，25℃、180 rpm 下培養(yǎng)8 d。在8 d 時加入以吐溫20 為助劑配制的MeJA，使MeJA 終濃度分別為100，150，200，250 和300 μM 的PD 液體培養(yǎng)基為試驗組培養(yǎng)菌絲體，只加入無菌水的PD 液體培養(yǎng)基為對照組CK，誘導48 h，收集菌絲，分別提取總RNA，將提取到的總RNA 用Prime Script ? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR）技術，將α-tubulin 作為內(nèi)參基因（表1），每組樣品設置3 個重復。據(jù)不同Ct 值，按公式2－△△Ct計算不同處理中的基因相對表達量[21-22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbTps2 基因及啟動子克隆

用暴馬桑黃菌絲總RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，SbTps2-F1和SbTps2-R1為引物擴增得到PCR 產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，在1 000～1 500 bp 之間出現(xiàn)特異性條帶（圖2），與預測目的片段大小（1 227 bp）一致。純化回收產(chǎn)物送至哈爾濱擎科生物公司測序。以SbTps2-pro-F2、SbTps2-pro-R2為引物，克隆SbTps2 基因啟動子。與預期大小1 220 bp 一致，結(jié)果如圖2所示。

小蟬氣的怔怔的，瞅著冷笑道：“我可拿什么比你們，又有人進貢，又有人作干奴才，溜你們好上好兒，幫襯著說句話兒?！?第六十回)

圖2 SbTps2 基因cDNA、啟動子PCR 擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of the cDNA and promoter of SbTps2

2.2 SbTps2 基因生物信息學分析

基于轉(zhuǎn)錄組基因序列信息，以暴馬桑黃菌絲cDNA 為模板，利用PCR 技術獲得SbTps2基因cDNA 全長序列。該序列全長1 227 bp（圖3），其中開放閱讀框（ORF）為1 227 bp，編碼407 個氨基酸，SbTps2基因cDNA 序列及對應的氨基酸序列見圖3。根據(jù)暴馬桑黃基因組已知的序列，并結(jié)合SbTps2基因 cDNA 測序結(jié)果，用在線軟件（http://gsds.gao-lab.org/）對SbTps2基因的外顯子和內(nèi)含子進行預測。分析表明，SbTps2基因包含3個外顯子（核苷酸0～527、592～898 和953～1 348 bp）和兩個內(nèi)含子（528～591 和899～952 bp，如圖4）。

圖3 SbTps2 基因cDNA 序列及推測的氨基酸序列Fig.3 The cDNA of SbTps2 and its predicted amino acid sequence

圖4 SbTps2 基因的外顯子和內(nèi)含子預測結(jié)果Fig.4 Exon and intron prediction of SbTps2

2.3 啟動子序列生物信息學分析

2.3.1 作用元件預測及分析

利用在線軟件Gene promoter miner 和Plantcare 預測該啟動子作用元件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含有典型啟動子的作用元件（圖5）：5 個TATAbox（核心啟動子元件）、9 個CAAT-box（啟動子和增強子區(qū)域的共同順式作用元件）。除了具有典型特征的保守序列外，該序列中還含有參與光響應的順式作用調(diào)控元件G-box、I-box，參與MeJA 響應的順式作用調(diào)節(jié)元件TGACG-motif，參與干旱誘導的MYB 結(jié)合位點MBS 以及參與厭氧誘導所必需的順式作用調(diào)節(jié)元件ARE 等其他元件。

圖5 SbTps2 啟動子的主要作用元件及位置Fig.5 The main cis-acting elements in the SbTps2 promoter

2.3.2 核心啟動區(qū)預測及分析

核心啟動子區(qū)是轉(zhuǎn)錄因子和RNA 聚合酶結(jié)合的區(qū)域，對啟動子的活性有較大的影響。Neural network promoter prediction 預測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SbTps2基因啟動子序列中含有2 處核心啟動子區(qū)（表2），其中367～467 bp之間是核心啟動子區(qū)的概率最高。

表2 SbTps2 基因啟動子核心啟動子區(qū)?Table 2 The core promoter region of SbTps2

2.4 SbTps2 蛋白生物信息學分析

2.4.1 SbTps2 蛋白理化性質(zhì)分析

用在線軟件分析結(jié)果表明，SbTps2基因cDNA 序列長1 227 bp，編碼407 個氨基酸，蛋白分子量為45.73 kDa，理論等電點5.89，氨基酸含量最高的為亮氨酸Leu(12.7%)，含量最低的為組氨酸His(1.2%)；疏水性指標為-0.224，疏水性指標為負值，說明SbTps2 蛋白為親水性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)63.89，大于40，因此該蛋白是一種不穩(wěn)定蛋白[23]。

2.4.2 SbTps2 蛋白保守序列預測分析

保守結(jié)構(gòu)域是判斷一個蛋白是否屬于倍半萜合酶的基本依據(jù)，其基序的突變會導致酶的催化活性降低或者產(chǎn)生異常的產(chǎn)物[24]。通過NCBI 網(wǎng)站上的Conserved domains 程序比對結(jié)果如圖6 所示，得出序列與Isoprenoid Biosynthesis enzymes Class1 和Superfamily of trans-isoprenyl diphosphate synthases 最為相似，含有1 個超家族Isoprenoid-Biosyn-C1 保守區(qū)，E-value 僅為8.16e-13，具有類異戊二烯生物合成酶和反式異戊二烯二磷酸合成酶超家族的保守序列。

圖6 SbTps2 蛋白保守序列預測Fig.6 Prediction of the conserved sequences of SbTps2 protein

2.4.3 SbTps2 蛋白跨膜區(qū)預測

跨膜區(qū)是氨基酸序列中跨越細胞膜的區(qū)域，能預測1 個蛋白是否具有傳遞物質(zhì)及信號的功能，使用TMHMM 預測SbTps2 蛋白跨膜區(qū)結(jié)果如圖7所示，該蛋白所有的氨基酸序列（1～400 位）都位于細胞膜外部。說明該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)，是非跨膜蛋白。

圖7 SbTps2 蛋白跨膜區(qū)預測Fig.7 Prediction of the transmembrane region of SbTps2

2.4.4 SbTps2 蛋白信號肽預測

信號肽序列負責將蛋白質(zhì)引導到具有不同膜結(jié)構(gòu)的細胞亞細胞器中去發(fā)揮功能，用SignalP對SbTps2 蛋白信號肽進行預測，結(jié)果表明該蛋白中不存在信號肽剪切位點（圖8）。

圖8 SbTps2 蛋白信號肽預測Fig.8 Signal peptide prediction of SbTps2

2.4.5 SbTps2 蛋白高級結(jié)構(gòu)預測

使用SPOMA 對SbTps2 蛋白二維結(jié)構(gòu)預測分析，結(jié)果顯示該蛋白含有213個α螺旋，占52.08%，其中8.31%處于延伸鏈、2.20%處于β轉(zhuǎn)彎、2.73%處于彎曲區(qū)域、37.41%處于無規(guī)則卷曲狀態(tài)，說明該蛋白大部分氨基酸序列都處于螺旋卷曲狀態(tài)，二級結(jié)構(gòu)分析如圖9 所示。使用Swiss model 預測SbTps2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示SbTps2 蛋白三級結(jié)構(gòu)是以Terpene synthase metal-binding domain-containing protein 蛋白結(jié)構(gòu)（4okm.1.A）為模板構(gòu)建的（圖10），建模殘基范圍是第33 位氨基酸到第388 位氨基酸。

圖9 SbTps2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測Fig.9 Prediction of the secondary structure of SbTps2 protein

2.4.6 SbTps2 蛋白多序列比對

SbTps2 蛋白與其他真菌類倍半萜合酶蛋白的多序列比對分析如圖11 所示，使用DNA MAN 軟件將SbTps2 蛋白與硬柄小皮傘、茶樹菇和灰蓋鬼傘的倍半萜合酶基因氨基酸序列進行多重序列比對（圖11），比對結(jié)果表明，不同真菌的倍半萜結(jié)構(gòu)域的組成上有個別差異，但是大部分殘基十分保守。

圖11 SbTps2 蛋白與其他真菌類倍半萜合酶蛋白的多序列比對結(jié)果Fig.11 Multiple alignment analysis of SbTps2 proteins among different fungi

2.4.7 SbTps2 系統(tǒng)發(fā)育分析

暴馬桑黃倍半萜合酶蛋白與其他已經(jīng)鑒定的物種倍半萜合酶[7]和NCBI 上相近的倍半萜合酶的系統(tǒng)進化分析如圖12 所示，根據(jù)系統(tǒng)進化樹聚類，可以看出SbTps2 蛋白與不同種物質(zhì)的倍半萜合酶基因聚為一類，因此可以推斷該基因為倍半萜合酶基因。

圖12 SbTps2 蛋白NJ 系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.12 Neighbor-joining phylogenetic tree of SbTps2 proteins

2.5 MeJA對SbTps2 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了了解不同濃度MeJA 處理條件下，SbTps2基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達特征，以SbTps2-F3、SbTps2-R3為引物（表1），利用實時熒光定量PCR 技術分析了SbTps2基因的相對表達量。不同濃度MeJA 處理對SbTps2基因相對表達量影響結(jié)果如圖13 所示。無菌水對基因的表達不產(chǎn)生影響，吐溫抑制基因的表達（是無菌水的0.496 倍），茉莉酸甲酯濃度100 μM 至200 μM時，基因表達量呈上升趨勢，并在MeJA 濃度為200 μM 時，基因表達量達到峰值（是無菌水的1.50倍）。之后隨著MeJA 濃度的提高，基因表達量降低，MeJA 濃度為300 μM 時，基因表達量達到最低值。說明添加適宜濃度的MeJA 能促進基因的表達。

圖13 不同濃度MeJA 誘導下SbTps2 基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.13 The transcription level of SbTps2 under different concentrations of MeJA

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

暴馬桑黃是一種著名的藥用真菌，其產(chǎn)生的倍半萜具有抗氧化和抗病毒活性，但是暴馬桑黃中倍半萜的含量較低。通過對暴馬桑黃倍半萜合酶基因進行誘導，可以達到增加倍半萜化合物產(chǎn)量的目的。

本研究克隆了暴馬桑黃倍半萜合酶基因SbTps2的全長序列，其基因全長1 227 bp，編碼407 個氨基酸。生物信息學分析結(jié)果表明，SbTps2蛋白無跨膜蛋白與信號肽，該結(jié)果與靈芝、鮑姆纖孔菌中報道的倍半萜合酶基因以及與SbTps1 蛋白結(jié)果一致[16-17,25]；SbTps2 蛋白為不穩(wěn)定蛋白，該結(jié)果與靈芝、紫芝里報道的倍半萜合酶蛋白以及與SbTps1 蛋白[9,17,25]結(jié)果一致，但是與鮑姆纖孔菌[16]中的結(jié)果不符；SbTps2 蛋白為親水性蛋白，該結(jié)果與鮑姆纖孔菌中報道的倍半萜合酶蛋白以及與SbTps1 蛋白結(jié)果一致[16-17]；預測保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)SbTps2 蛋白序列含有與SbTps1 蛋白一樣的保守區(qū)，但是SbTps2 與SbTps1 蛋白的具有不同的功能[17]；根據(jù)系統(tǒng)進化樹的聚類，可以看出SbTps2 蛋白與不同種物質(zhì)的倍半萜合酶基因聚為一類，其中SbTps2 蛋白與紫芝倍半萜合酶蛋白聚為一支，因為紫芝與暴馬桑黃均屬于擔子菌，在進化關系上具有相似性。

此外，本研究克隆了SbTps2啟動子，發(fā)現(xiàn)其含有2 處核心啟動子區(qū)，且存在MeJA 響應元件CGTCA-motif，暗示該啟動子能夠響應MeJA 誘導表達。

暴馬桑黃倍半萜含量的多少受基因的調(diào)控，而基因的表達受外界環(huán)境的影響。MeJA 是一種重要的信號分子，具有廣譜的生理效應，以往的研究表明MeJA 不僅可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、刺激植物次生代謝產(chǎn)物的合成，而且能夠激活植物的防御反應以及防御基因的表達。然而關于MeJA誘導暴馬桑黃菌體內(nèi)倍半萜的合成以及關鍵酶基因表達的研究鮮見報道。本研究利用實時熒光定量PCR 技術分析SbTps2基因的相對表達量發(fā)現(xiàn)，當MeJA 濃度為200 μM時SbTps2基因的相對表達量與無菌水比提高了1.50 倍，這一結(jié)果表明，適宜濃度的MeJA 可以促進SbTps2基因的表達。在鮑姆纖孔菌中，用MeJA 進行誘導，提高了Unigene1790等基因的表達量[16]；在靈芝中，MeJA 處理顯著提高了HMGR、SQS和OSC基因的轉(zhuǎn)錄水平[26]，與本結(jié)果相符。

綜上，熒光定量結(jié)果在一定程度上說明適宜濃度的MeJA 可促進SbTps2基因的表達。研究結(jié)果為從分子水平上調(diào)控SbTps2基因表達量，同時為揭示暴馬桑黃倍半萜合成機制的研究提供理論基礎。然而，SbTps2基因究竟在倍半萜形成的過程起著怎樣的作用，與信號通路中其他的基因如何相互作用共同調(diào)控響應MeJA 信號途徑相關基因的表達有待深入的研究。

3.2 結(jié)論

本研究克隆了暴馬桑黃倍半萜合酶基因SbTps2的全長序列，該基因全長為1 227 bp，編碼407 個氨基酸，生物信息學分析結(jié)果表明，SbTps2蛋白無跨膜蛋白與信號肽；同時，本研究克隆了SbTps2啟動子序列，啟動子長度為1 220 bp，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其含有2 處核心啟動子區(qū)，且存在MeJA 響應元件CGTCA-motif；利用實時熒光定量PCR 技術分析不同MeJA 濃度誘導下SbTps2基因的相對表達量，發(fā)現(xiàn)當MeJA 濃度為200 μM時SbTps2基因的相對表達量與無菌水比提高了1.50 倍，與鮑姆纖孔菌中MeJA 誘導倍半萜合酶基因Unigene1790的結(jié)論一致。結(jié)果表明，適宜濃度的MeJA 可以促進SbTps2基因的表達。