周韜，白 磊，何其浩，王平

（中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術(shù)學院，湖南 長沙 410004）

林木轉(zhuǎn)基因研究起始于20 世紀80 年代末[1]，開始主要是利用一些標簽基因研究樹木的轉(zhuǎn)化。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，進入90 年代后，具有技術(shù)價值的基因如抗蟲、抗除草劑基因陸續(xù)被導入到一些林木中。植物基因工程技術(shù)在林木中的應用彌補了常規(guī)育種周期長、定向改良難以控制、遠緣雜交或種間雜交難以實現(xiàn)的困難與不足[1]。但樹木生長在開放的自然環(huán)境中會遇到各種惡劣的環(huán)境，如重金屬、高鹽堿等。因此，抗環(huán)境脅迫的基因工程成為林木遺傳改良的重要領(lǐng)域[2]。木本植物穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化涉及基因組整合與再生過程，目的在于使外源基因不僅能在后代植株中穩(wěn)定表達，還需具備遺傳特性，從而研究某種基因功能或改良某種植物性狀[3]。目前針對林木進行了遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究，有農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化、電穿孔法和PEG 誘導法轉(zhuǎn)化等[4]。農(nóng)桿菌介導法以其費用低、拷貝數(shù)低、重復性好、基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨特優(yōu)點而備受科學工作者的青睞[5]。Cd 污染危害植物根系，造成根系生理代謝失調(diào)，生長受到抑制[6]。欒樹因其根系發(fā)達、環(huán)境適應性強，研究者將其應用于重金屬污染土壤的修復并取得了良好的效果[7]。同一植物對不同重金屬富集量也不同，如重金屬在土壤—檜柏Sabina chinensis系統(tǒng)中的富集能力依次為 鎘（Cd）＞鋅（Zn）＞汞（Hg）＞鉛（Pb）[8]。造成植物體內(nèi)重金屬含量不同的原因有很多，從根向地上部運輸能力的差異是其中之一[9]。由于植物組織對重金屬的轉(zhuǎn)移和運輸具有一種屏蔽作用，能阻止重金屬從地下部向地上部轉(zhuǎn)移，所以一般認為，重金屬在植物器官中的累積量為根＞莖＞葉[10]。欒樹同樣存在這個問題，富集的Cd 大量存在于根部，很難向地上部運輸[11]，且欒樹的生長周期緩慢，很難短時間對Cd 重污染地區(qū)產(chǎn)生影響。HMA家族基因（Heavy metal ATPase）中的HMA基因是P1B-ATPase 家族的成員[11]，目前對該家族基因的研究多集中在HMA2/HMA3/HMA4上，且以擬南芥和水稻等植物為主。AtHMA3主要介導Cd 和Pb 的轉(zhuǎn)運，通過酵母互補試驗發(fā)現(xiàn)其能互補Cd/Pb 敏感型菌株ycf1，而不能互補Zn 敏感型菌株zrc1[12]。AtHMA3基因主要定位于液泡膜上，過表達后植物體內(nèi)Cd 含量比野生型增加了2～3 倍，說明AtHMA3主要通過將Cd等重金屬轉(zhuǎn)運至液泡里，從而起到解毒的作用[13]。Morel等[14]利用QTL 方法從低累積Cd 的水稻中定位到一個OsHMA3基因，他是一個特異性的Cd轉(zhuǎn)運基因，主要在根部表達，通過將Cd 轉(zhuǎn)運到根部細胞的液泡中儲存，從而減少了Cd 向地上部轉(zhuǎn)運。上述研究表明，HMA基因在植物對重金屬的轉(zhuǎn)運和解毒，特別是在維持鋅鎘等重金屬在細胞中的穩(wěn)態(tài)過程中起到了非常關(guān)鍵的作用。因此，本研究計劃構(gòu)建欒樹遺傳轉(zhuǎn)化體系并將超轉(zhuǎn)運蛋白HMA3 轉(zhuǎn)入欒樹，以實現(xiàn)欒樹的定向改良，使其對Cd 的富集能力和轉(zhuǎn)運能力獲得顯著提升。

1 材料與方法

1.1 材料

基因型分析內(nèi)參為番茄，轉(zhuǎn)化受體材料為復羽葉欒樹；轉(zhuǎn)化菌株為農(nóng)桿菌LBA4404；轉(zhuǎn)化載體為pCAMBIA1302[15]。

1.2 流式細胞術(shù)對欒樹進行基因型分析

將樣品置于0.8 mL預冷的MGb解離液（45 mM MgCl2·6H2O,20 mM MOPS,30 mM 檸檬酸鈉,1%(W/V) PVP 40，0.2% (V/V) Tritonx-100，10 mM Na2EDTA,20 μL/mLβ-巰基乙醇，pH 值7.5）中，用刀片將組織切碎，使其在解離液中冰上靜置10 min，然后用400 目濾網(wǎng)過濾，即得到細胞核懸浮液。在細胞核懸液中加入適當體積的預冷的碘化丙啶（Propidium iodide，PI）（母液濃度1 mg/mL）和適當體積的RNAase 溶液（母液濃度1 mg/mL），置于冰上避光染色0.5～1 h。PI 染液和RNAase溶液的工作濃度均為50 μg/mL。

以番茄為內(nèi)參，將待測樣品的懸液和內(nèi)參樣品的懸液按適當比例混合。利用BD FACScalibur流式細胞儀對染色后的細胞核懸浮液樣品上機檢測，采用488 nm 藍光激發(fā)，檢測碘化丙啶的發(fā)射光熒光強度，每次檢測收集10 000 個顆粒。變異系數(shù)CV%控制在5%以內(nèi)，使用Modifit 3.0 分析軟件作圖分析。

1.3 轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

以從超富集東南景天Sedum alfrediiHance 中提取的RNA 為模板（PureLink RNA 小量試劑盒），逆轉(zhuǎn)錄得到超富集東南景天的cDNA 文庫（SureScriptTMcDNA 第一條鏈合成試劑盒），設計特異性Cd 轉(zhuǎn)運HMA3基因序列（KM376975.1）的引物（F:5′ATGGATTCTGGATTGGATGAAGTCA3′，R：5′GGCATCCATCTGGCCTTTCGTCTTA3′），以cDNA 為模板，使用高保真酶KODFX(Takara)進行PCR 擴增，獲得超富集東南景天HMA3基因CDS 序列。BgI Ⅱ和Spe Ⅰ雙酶切PCR 純化產(chǎn)物及pCAMBIA1302 表達載體，然后通過DNA 連接酶進行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10 體內(nèi)，通過篩選克隆、酶切檢測以及測序分析獲得正確的HMA3基因的表達載體。最后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 愈傷組織的誘導及繼代

1.4.1 復羽葉欒樹種子萌發(fā)

將過6 目篩的欒樹種子進行65%～75%濃硫酸浸泡3～4 min 后，60 g/L 的碳酸氫鈉溶液反復清洗種子徹底中和濃硫酸，再利用60 g/L 的碳酸氫鈉水溶液浸泡種子10～12 min，然后對種子進行消毒處理：70%乙醇50 s，0.1%升汞2～10 min，無菌水沖洗3 次以上獲得無菌種子，最后將沖洗好的種子放到滅菌濾紙上晾干5 min。在每個倒有促萌發(fā)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中放入3～4 粒種子，放入培養(yǎng)箱（23±1℃）中光照培養(yǎng)，光照周期16/8，光照強度為40 μmolm-2s-1。經(jīng)過7 d 的培養(yǎng)，發(fā)芽成為無菌苗。（促萌發(fā)固體培養(yǎng)基為DKW基本培養(yǎng)基，6-BA，2.0 mg/L，NAA，0.4 mg/L，GA3，0.4 mg/L）。

1.4.2 復羽葉欒樹愈傷組織的誘導

將無菌苗切割，其中莖段與根系切割為0.5～1 cm，轉(zhuǎn)入愈傷組織快速誘導培養(yǎng)基上進行誘導，培養(yǎng)基設定添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）100 mg/L與無PVP，以及設定吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（2,4-D）、椰汁含量優(yōu)化欒樹愈傷組織培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱（23±1℃）、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)。經(jīng)過21 d 的黑暗誘導，挑選愈傷組織，用鑷子輕輕分為3 份，轉(zhuǎn)入新的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～30 d。

1.5 農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系建立

從固體劃線平板上挑取已轉(zhuǎn)化pCAMBIA1302-HMA3農(nóng)桿菌LBA4404 單克隆菌株，對欒樹愈傷組織進行侵染轉(zhuǎn)化具體操作步驟參考《植物基因工程》[16]。將抗性愈傷繼代增殖培養(yǎng)形成成熟的愈傷塊，繼代培養(yǎng)基設定細胞分裂素（6-BA），IBA、噻苯隆（TDZ）含量優(yōu)化欒樹繼代培養(yǎng)。將兩輪篩選后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到不定芽分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20～40 d 出現(xiàn)新的芽點，繼而轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，誘導生根。待幼苗長出較為發(fā)達的根系后進行移栽煉苗，除繼代培養(yǎng)基外其他培養(yǎng)基配方參考傳統(tǒng)植物組培培養(yǎng)基配方[17-18]。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的檢測

1.6.1 目的基因PCR 檢測

剪去植株的幼嫩葉片，液氮研磨，利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取欒樹抗性篩選后的愈傷組織RNA，PrimeScript ?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA 合成試劑盒（TaKaRa 公司）逆轉(zhuǎn)錄cDNA 作為模板，利用Premier5 設計目的基因東南景天HMA3（AJF37113.1）轉(zhuǎn)運蛋白引物，利用高保真酶進行PCR 克隆，反應條件：98℃2 min；98℃10 s，55℃30 s，72℃1 min，35 個循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳驗證目的基因已順利插入欒樹基因轉(zhuǎn)錄組。

1.6.2 欒樹原生質(zhì)體制備及激光共聚焦觀測GFP表達

取4 g 篩選后的愈傷組織，用鑷子輕輕搗碎，于30 mL 酶解前溶液漂洗3次，每次5min。（酶解前溶液：0.4MD-Mannitol、20 mM MES）。用孔徑為0.15 mm 的濾網(wǎng)過濾溶液，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至酶解液中（酶解液：20 mM MES、0.4M D-Mannitol、20 mM KCl、0.40% macerozyme R-10、1.50% Cellulase R-10，加ddH2O 至10 mL，用KOH 調(diào)pH 值至5.7，55℃，10 min，冷卻至室溫后加入隨后試劑至終濃度，10 mM CaCl2，0.1%BSA。加ddH2O 至30 mL）。錫紙包裹避光，于搖床中26 ℃、50 rpm 下?lián)u蕩，酶解6～10 h，去除離心管上層液2 mL。用孔徑為0.15 mm 濾網(wǎng)過濾，盡量減少濾液流動距離，動作輕柔，用等體積W5溶液（154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl，5 mM glucose，0.03% MES，KOH調(diào)pH值至5.8，高溫高壓滅菌20 min，4℃）可保存一個月，可以保持原生質(zhì)體的滲透壓，防止原生質(zhì)體破裂。清洗離心管及濾渣至酶解后溶液中，終止反應。去除濾渣，得到濾液后在顯微鏡觀察完整細胞比例，在激光共聚焦下觀測細胞中GFP 的瞬時表達。

1.7 轉(zhuǎn)基因欒樹Cd 吸附能力檢測

將轉(zhuǎn)基因陽性的欒樹幼苗與未轉(zhuǎn)基因的欒樹幼苗進行相同程度的Cd 脅迫處理。20 mg/L 處理7 d 后用HNO3-HClO4濕法消解測定。用自來水清洗干凈后用超純水潤洗，將新鮮的根、新長的嫩莖和葉分開。放入烘箱中105℃下殺青30 min 后將溫度降至80℃，烘干至恒質(zhì)量。用粉碎機粉碎，裝袋保存。稱取0.5 g 粉碎的植物樣品于100 mL三角瓶中，加入5 mL 濃硝酸，蓋上彎頸漏斗，搖勻后靜置過夜。次日，置于電熱板上，在通風櫥180℃下加熱30 min，每30 min 升高5℃，至4 h后棕色氣體基本趕完。取下三角瓶冷卻，加1.5 mL高氯酸，電熱板升高溫度至200℃加熱1～2 h 產(chǎn)生濃白煙揮發(fā)大部分高氯酸，至三角瓶中溶液為無色透明，植物殘渣為白色，取下冷卻。用去離子水過濾，定容于50 mL 的容量瓶，轉(zhuǎn)至75 mL小白瓶，根據(jù)樣品中各待測元素含量和儀器的最低檢測限值適當稀釋，最后用原子吸收分光光度計測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 復羽葉欒樹基因組大小分析

碘化丙啶是一種熒光染料，能均勻地嵌入到雙鏈核酸堿基對中，因此可以對DNA 進行特異性染色。在488 nm 激發(fā)光下，PI 發(fā)出的熒光可被流式細胞儀檢測。并且，PI 在著色過程中的嵌入量與DNA 量成正比，故熒光強度可以表示出基因組DNA 的相對含量。觀察待測樣品和對照植物PIDNA 復合體的熒光峰值，即可得出2 種植物DNA含量的比值，再乘以內(nèi)參植物的C 值，即可計算出待測植物的C 值。即計算公式：待測樣品DNA含量=內(nèi)參DNA 含量×待測樣品的熒光強度/內(nèi)參樣品的熒光強度。根據(jù)圖1 可知，測定3 組生物學重復欒樹葉片樣品，Modifit 3.0 計算峰圖面積得出樣品吸光度分別為20.32、21.62、20.28，剔除可能因采樣手段或樣品自身病變造成的誤差數(shù)據(jù)21.62，根據(jù)與內(nèi)參番茄相比可知欒樹基因組的大小為335 Mb 左右（表1 和圖1）。欒樹的基因型為2n=32[19]。較小的基因組以及二倍體的特性決定了欒樹有較好的遺傳性，插入的外源基因更不容易丟失，預示著復羽葉欒樹品種具有基因工程改良可能性，尤其是對于景觀栽培花色改良或環(huán)境應用修復植物品種選育都具有應用前景。

圖1 欒樹基因組大小結(jié)果直方圖Fig.1 Histogram of the Koelreuteria paniculata genome size

表1 欒樹相較于番茄基因組結(jié)果Table 1 Koelreuteria paniculata genome versus tomato genome

2.2 表達載體HMA3+pCAMBIA1302 的獲得

通過高保真酶PCR 擴增HMA3基因（ID：KM376975.1），將該基因通過雙酶切與酶連反應，連接到pCAMBIA1302 載體上，目的基因插入載體位置及該載體功能組件如圖2 所示。該載體具有潮霉素（Hyg）與卡那霉素（Kan）篩選位點，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟可利用Kan 抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。植物組培階段可利用Hyg 抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化組培植株，目的基因尾端連接有熒光蛋白（GFP）融合表達可用于后續(xù)的激光共聚焦觀察目的基因在細胞內(nèi)的表達細胞器部位分析表達模式。由此可見，該載體非常適用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建，可縮短轉(zhuǎn)化篩選步驟時間周期，且有利于后期基因表達純化及功能研究。轉(zhuǎn)入大腸桿菌T10 中獲得大量載體拷貝，提取質(zhì)粒進行酶切驗證（圖3），酶切后的目的基因大小為2 401 bp，符合東南景天HMA3基因大小，其余熒光片段為載體片段大于5 000 bp，進一步對質(zhì)粒進行測序比對，確定質(zhì)粒序列、堿基序列無移碼突變，可用于后續(xù)試驗。

圖2 pCAMBIA1302 質(zhì)粒圖譜Fig.2 pCAMBIA1302 plasmid

圖3 pCAMBIA1302 質(zhì)粒酶切驗證Fig.3 Validation of the digestion of pCAMBIA1302 plasmids

2.3 農(nóng)桿菌介導欒樹遺傳轉(zhuǎn)化

木本植物遺傳轉(zhuǎn)化效率普遍較低，嚴重阻礙了木本植物的轉(zhuǎn)基因工作開展。為了提高欒樹的轉(zhuǎn)化效率，對農(nóng)桿菌介導的欒樹遺傳轉(zhuǎn)化體系中的培養(yǎng)基配方進行了系統(tǒng)優(yōu)化，該體系可高效且穩(wěn)定地獲得欒樹遺傳轉(zhuǎn)化幼苗（圖4）。相對于已有報道的傳統(tǒng)植物培養(yǎng)基，本研究對愈傷組織誘導培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)化后愈傷組織繼代培養(yǎng)基配方進行了大幅度的優(yōu)化，使欒樹愈傷組織形成與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)可穩(wěn)定獲得目的基因轉(zhuǎn)化植株。在愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）防止愈傷組織褐化，而相較于未加 PVP 組欒樹，愈傷組織的抗褐化能力有了明顯的提升（圖5），每10 瓶欒樹愈傷組織培養(yǎng)過程中未添加PVP 出現(xiàn)個體愈傷組織褐化率約為56.1%，添加后降低至33.1%，PVP 極顯著降低了愈傷組織褐化率。0.25 mg/L IBA，1.0 mg/L 2,4-D 及10%的椰汁，使得欒樹愈傷組織的誘導成功率與繼代成長速度都有了明顯的提升，同時有效地減少了在潮霉素抗性篩選培養(yǎng)基中的玻璃化幼苗的產(chǎn)生（表2～3）?？梢?，優(yōu)化后的培養(yǎng)基對于欒樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建明顯優(yōu)于傳統(tǒng)植物組織培養(yǎng)基，提高愈傷組織獲得效率，降低了抗性篩選過程中對欒樹轉(zhuǎn)化后的愈傷組織的消耗。

表2 欒樹愈傷組織誘導培養(yǎng)基Table 2 Callus induction medium of Koelreuteria paniculata

圖4 欒樹遺傳轉(zhuǎn)化體系培育動態(tài)Fig.4 Dynamic diagram of Koelreuteria paniculata culture in the genetic transformation system

圖5 欒樹愈傷組織褐化率Fig.5 Callus browning rate of Koelreuteria paniculata

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的激光共聚焦檢測，PCR 檢測及陽性苗的獲得

將經(jīng)過抗性篩選的部分陽性愈傷組織制備成原生質(zhì)體，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖6 所示。目的基因與GFP 為融合表達基因，且HMA3 為跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，在激光共聚焦下GFP發(fā)出綠色熒光，其表達模式與目的基因一致，都在欒樹原生質(zhì)體細胞膜附近。以獲得的抗性轉(zhuǎn)化苗的葉片總DNA 為模板，以AJF37113.1F/R為引物進行PCR 擴增反應，分別取PCR 產(chǎn)物5 μL，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如圖7 所示，共檢測隨機植株17 株，其中可以擴增出HMA3基因的有5 株，據(jù)此獲得的陽性率即成功表達HMA3基因植株得率為29.4%。同時激光共聚焦結(jié)果表明，東南景天HMA3基因在欒樹細胞中的表達具有相同的表達模式即細胞膜表達，進一步說明該基因的生物學功能可能會在欒樹中產(chǎn)生相關(guān)表型。

圖6 欒樹陽性轉(zhuǎn)化愈傷組織原生質(zhì)體GFP 激光共聚焦亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of the positive callus protoplasts of Koelreuteria paniculata observed by GFP laser confocal

圖7 欒樹轉(zhuǎn)化再生植株P(guān)CR 檢測結(jié)果Fig.7 PCR detection results of the transformed Koelreuteria paniculata plants

2.5 轉(zhuǎn)基因欒樹Cd 富集能力檢測

表3 欒樹轉(zhuǎn)化愈傷組織繼代培養(yǎng)基Table 3 Medium for the subculture of Koelreuteria paniculata callus

欒樹作為對Cd 有一定富集能力的木本植物，其本身對Cd 吸收后主要富集于地下部分，即主要位于根部，較難向地上部運輸。特別是隨著Cd 濃度的升高，其轉(zhuǎn)運能力進一步降低[15]。轉(zhuǎn)入HMA3基因后，轉(zhuǎn)基因欒樹獲得了更強的富集能力與轉(zhuǎn)運能力。相較于陰性對照，其整體富集Cd 含量增加了40.3%，根部富集Cd 含量增加了26.2%，且地上部（莖、葉）的Cd 含量占比相較于陰性對照提升了62.9%。欒樹對Cd 的富集系數(shù)（Bioconcentration factors,BCF，為欒樹體內(nèi)Cd 含量除以水培液中的Cd 含量）提升了40.3%；轉(zhuǎn)運系數(shù)（Translocation factors,TF，為欒樹地上部Cd含量除以地下部的Cd 含量）提升了29.3%（表4）。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)入HMA3基因的欒樹幼苗有更強的富集能力和轉(zhuǎn)運能力，該結(jié)果證明了東南景天HMA3 蛋白在欒樹中同樣行使了Cd 轉(zhuǎn)運功能，且使欒樹富集系數(shù)與轉(zhuǎn)運系數(shù)發(fā)生了顯著性變化。然而與同生物量草本植物相比仍然處于劣勢，這可能是由于植物響應Cd 脅迫反應并非點反應，而是復雜的基因網(wǎng)絡調(diào)控響應，木本植物與草本植物相比仍然具有較大差異。因此，東南景天HMA3基因在欒樹細胞內(nèi)并沒有完全發(fā)揮特異性轉(zhuǎn)運Cd的生物學功能。

表4 欒樹根、莖、葉中Cd 濃度及其亞細胞結(jié)構(gòu)分布?Table 4 Cd concentration and subcellular structure distribution in roots,stems and leaves of Koelreuteria paniculata

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

重金屬植物修復技術(shù)因其低成本和無害化而被廣泛應用，植物修復應用于重金屬的修復技術(shù)可分為3 個類型，植物提取、植物揮發(fā)、植物穩(wěn)定。欒樹是我國南方地區(qū)一種常見的綠化樹種，因其根系發(fā)達、環(huán)境適應性強，研究者將其應用于重金屬污染土壤的修復并取得了良好的效果。在湘潭錳礦區(qū)成功建成以欒樹為修復樹種的生態(tài)修復基地，開創(chuàng)了我國欒樹修復重金屬礦區(qū)的先例。選用欒樹、千頭柏、棕櫚、灑金柏等植物進行土培試驗，發(fā)現(xiàn)欒樹對重金屬礦渣土壤基質(zhì)的適應性很強，是用于重金屬礦渣廢棄地生態(tài)修復的理想樹種。

然而，欒樹卻很難將地下部分（根部）富集的Cd 轉(zhuǎn)運至地上部分（莖，葉），無法發(fā)揮其生物量大的優(yōu)勢。本研究組前期轉(zhuǎn)錄組分析研究表明，欒樹響應Cd 脅迫主要通過根系的吸附作用實現(xiàn)，其分子機理可能是欒樹根系具有響應Cd脅迫分泌根系代謝物，螯合Cd 離子阻遏進入細胞質(zhì)，且轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示欒樹并不具有特異性高表達響應Cd 脅迫的金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白，這與大部分高抗性木本植物研究報道的結(jié)果一致[20-22]，因此，欒樹具有較強的Cd 抗性而不具備高富集性的分子機制。欒樹作為環(huán)境修復植物的應用雖具有生態(tài)修復的主要承載體價值[23]，卻缺乏高效修復的屬性。隨著基因工程的發(fā)展，篩選利用特異性Cd 轉(zhuǎn)運基因?qū)铇涞母患硇透脑鞂⒂欣诮鉀Q這一問題。

首先通過對比番茄的基因組，發(fā)現(xiàn)欒樹的基因組大小為335 Mb 左右，具有較小的基因組以及二倍體的特性，使得欒樹在遺傳轉(zhuǎn)化上有著更大的優(yōu)勢。然而，林木轉(zhuǎn)基因技術(shù)的難題主要在不定芽與不定根的誘導[24]以及目的基因的準確表達，我們通過優(yōu)化培養(yǎng)基的激素配比，同時在其中加入PVP 預防褐化，成功誘導形成了欒樹愈傷組織，并誘導其長出不定芽與不定根，說明本研究的激素配方適宜欒樹的無性繁殖體系，這有力地保障了欒樹快繁的同時，使得轉(zhuǎn)化基因的穩(wěn)定遺傳成為可能。轉(zhuǎn)運蛋白HMA 家族是一種對重金屬特異性很強的轉(zhuǎn)運蛋白，通過轉(zhuǎn)運金屬離子參與細胞內(nèi)的信號調(diào)節(jié)，其中擬南芥中的AtHMA3主要介導Cd 與Pb 的轉(zhuǎn)運。東南景天同樣具有特異性Cd轉(zhuǎn)運富集的HMA3基因，且僅存在于超富集東南景天中，該基因在東南景天中的生物學功能主要表現(xiàn)為將地下部的Cd 離子轉(zhuǎn)運至地上部，并且通過跨膜運輸富集于植物液泡中，使得超富集東南景天具有高富集性的同時具有高Cd 抗性[25]。因此，本研究成功克隆了超富集東南景天Cd 特異性的超轉(zhuǎn)運蛋白HMA3基因，利用農(nóng)桿菌介導的方式轉(zhuǎn)入欒樹愈傷組織，通過篩選培養(yǎng)，選育陽性幼苗，以及表達模式分析得出草本植物東南景天的HMA3基因在欒樹中同樣具有表達與Cd 轉(zhuǎn)運生物學功能。最后對轉(zhuǎn)基因欒樹Cd 脅迫試驗可以得出，轉(zhuǎn)入HMA3基因的欒樹幼苗，對Cd 的富集能力，由地下部轉(zhuǎn)移至地上部的能力均有顯著提升，但是相較于超富集草本植物，其相同生物量的富集系仍然較低，說明木本植物存在復雜的Cd 脅迫響應機制，并非改變轉(zhuǎn)運基因就能獲得相同的轉(zhuǎn)運效率與富集量，因此，欒樹的Cd 脅迫響應機制的揭示有待進一步研究。

3.2 結(jié)論

本研究建立了由農(nóng)桿菌介導的欒樹遺傳轉(zhuǎn)化體系，其最佳轉(zhuǎn)化體系為：欒樹愈傷組織誘導培養(yǎng)基：0.25 mg/L IBA，1.0 mg/L 2,4-D，100 mg/LPVP 及10%的椰汁；欒樹愈傷組織繼代培養(yǎng)基：1.0 mg/L 6-BA，0.1 mg/L IBA，0.5 mg/L TDZ，100 mg/L PVP 及10%的椰汁，并成功轉(zhuǎn)入東南景天HMA3基因，使得欒樹對Cd 的富集能力得到了顯著的提升，該結(jié)果將為后續(xù)研究欒樹逆境分子機制下的基因調(diào)控網(wǎng)絡提供技術(shù)支持。