周 寧 王金金 李紅偉 張振凌 李凱?

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)， 河南 鄭州450046； 2.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心， 河南 鄭州450046）

補(bǔ)骨脂丸來(lái)源于宋代《魏氏家藏方》第六卷脾腎篇，由鹽補(bǔ)骨脂、鹽小茴香組成，用于治療脾腎陽(yáng)虛所致的遺精、遺尿、尿頻，大便溏、食欲不振等癥狀［1?2］。課題組前期建立了脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠模型，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂丸溫腎助陽(yáng)、暖脾止瀉作用優(yōu)于補(bǔ)骨脂，而且鹽炙后效果更強(qiáng)［3］，但在炮制過(guò)程中補(bǔ)骨脂丸主要成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素煎出量呈降低趨勢(shì)［4］，可能還與體內(nèi)吸收有關(guān)，故需進(jìn)一步研究上述2 種成分的體內(nèi)吸收規(guī)律［5?6］。

在病理模型上開展藥動(dòng)學(xué)研究時(shí)，能更深入全面地闡明補(bǔ)骨脂、小茴香鹽炙配伍對(duì)脾虛泄瀉大鼠的增效機(jī)制，也更貼近臨床實(shí)際［7?8］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠模型，考察鹽炙對(duì)補(bǔ)骨脂丸中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素體內(nèi)吸收的影響，探討增強(qiáng)止瀉作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以期為闡釋該制劑中藥材炮制機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC?20ADXR 高效液相色譜儀（日本島津公司）；FA2104B 電子天平［上海越平科學(xué)儀器（蘇州）制造有限公司］；Sartorius BT25S 型電子分析天平［十萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；KQ?500DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZTW 型電子調(diào)溫電熱套（天津工業(yè)實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；ZNHW 型智能恒溫電熱套（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TGL?16M 型高速冷凍離心機(jī)（常州金壇良友儀器有限公司）；多管渦旋振蕩器；NV?15G 型氮吹儀（上海精密儀器儀表有限公司）；N?1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；0.5～10、5～50、20～200、100～1 000 μL 移液槍［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］。

1.2 試劑與藥物 補(bǔ)骨脂（批號(hào)180301）、番瀉葉（批號(hào)180901）購(gòu)自亳州市張仲景中藥飲片有限責(zé)任公司；小茴香（批號(hào)170101）購(gòu)自亳州市永剛飲片廠有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為正品。氫化可的松注射液（批號(hào)21805101）購(gòu)自遂成藥業(yè)股份有限公司；氯霉素（批號(hào)Y15F10C80504）及補(bǔ)骨脂素（批號(hào)C12J8Q39802）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)Y18O8H46134）對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，體質(zhì)量210～250 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）2019?0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（豫）2015?0005，飼養(yǎng)于相對(duì)濕度45%～70%、溫度22～26 ℃的清潔級(jí)動(dòng)物房中。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBOX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～2 min，95%～80%B；2～5 min，80%～68%B；5～8 min，68%B；8～9 min，68%～55%B；9～14 min，55%B）；體積流量0.4 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.029 0、1.005 0 mg／mL 的貯備液，分別精密量取適量，混合后甲醇制成質(zhì)量濃度分別為82.320 0、48.240 0 μg／mL 的溶液，逐級(jí)稀釋，即得（補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度分別為82.320 0、41.160 0、10.290 0、4.116 0、2.058 0、0.411 6、0.274 4 μg／mL，異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度分別為48.240 0、24.120 0、6.030 0、2.412 0、1.206 0、0.241 2、0.160 8 μg／mL）。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取氯霉素適量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，即得（質(zhì)量濃度為20.060 0 μg／mL），置于4 ℃冰箱中備用。

2.3 鹽炙品制備

2.3.1 補(bǔ)骨脂 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道，取凈補(bǔ)骨脂飲片適量，加20% 鹽水（每100 g 補(bǔ)骨脂用10 mL鹽水）拌勻，悶潤(rùn)4 h，置于炒制容器中，文火加熱，炒制8.5 min，待表面黑色或黑褐色、微鼓起、氣微香、味微咸時(shí)出鍋，晾涼，即得。

2.3.2 小茴香 參考文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道，取凈小茴香飲片適量，加20% 鹽水（每100 g 小茴香用10 mL鹽水）拌勻，悶潤(rùn)，待鹽水被吸盡后置于炒制容器中，文火加熱，炒至微黃、微鼓起、色澤加深、偶有焦斑、味微咸時(shí)出鍋，晾涼，即得。

2.4 水煎液制備

2.4.1 補(bǔ)骨脂丸 取鹽補(bǔ)骨脂12 g＋鹽小茴香12 g（補(bǔ)骨脂丸）、鹽補(bǔ)骨脂12 g＋生小茴香12 g（模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅰ）、生補(bǔ)骨脂12 g＋鹽小茴香12 g（模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅱ）、生補(bǔ)骨脂12 g＋生小茴香12 g（模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅲ），搗碎，過(guò)1 號(hào)篩，置于圓底燒瓶中，加8 倍量水浸泡30 min，回流提取30 min，濾過(guò)，再加6 倍量水回流提取30 min，濾過(guò)，合并2 次濾液，減壓濃縮至生藥量0.8 g／mL，即得（課題組前期測(cè)得補(bǔ)骨脂丸及模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中補(bǔ)骨脂素含量分別為0.134 7%、0.133 6%、0.221 8%、0.224 4%，異補(bǔ)骨脂素含量分別為0.104 4%、0.100 9%、0.172 5%、0.170 5%，氯化鈉含量分別為0.032、0.016、0.016、0 g／mL）。

2.4.2 番瀉葉 取番瀉葉適量，浸泡30 min 后加水煮沸10 min，2 層紗布濾過(guò)，濾液減壓濃縮至生藥量1.0 g／mL，即得，置于冰箱中保存。

2.5 分組、造模與給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白組、補(bǔ)骨脂丸組及模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組6只，除空白組以外其余各組大鼠先進(jìn)行脾腎陽(yáng)虛泄瀉模型造模［11?13］，即每天上午灌胃給予氫化可的松注射液（15 mg／kg）以致腎陽(yáng)虛，連續(xù)14 d，從第15 天開始每天灌胃給予冰番瀉葉水煎液（10 g／kg）以致脾陽(yáng)虛瀉下，連續(xù)14 d。大鼠在給藥前12 h 和給藥后禁食，自由飲水，補(bǔ)骨脂丸組及模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組按8 g／kg 劑量灌胃給予相應(yīng)藥物，空白組灌胃給予等量生理鹽水。

2.6 血漿采集與處理 大鼠給藥后，于0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、7、9、12、24 h 眼眶靜脈叢取血各約0.5 mL，置于1.5 mL 含肝素鈉的試管中，4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中冷凍保存。

檢測(cè)前將血漿取出，冰水浴解凍，精密量取100 μL 至1.5 mL 離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL、乙腈400 μL，渦 旋3 min，12 000 r／min離心10 min，吸取上清液，氮?dú)獯蹈桑?0 μL 甲醇復(fù)溶，超聲處理2 min，渦旋3 min，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，置于100 μL 帶有內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性試驗(yàn) 取空白血漿、空白血漿＋內(nèi)標(biāo)＋對(duì)照品（補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度分別為4.116 0、2.412 0 μg／mL）、給藥后24 h 血漿＋內(nèi)標(biāo)溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形理想，內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.2 線性關(guān)系考察 精密量取空白血漿100 μL，加入對(duì)照品溶液50 μL、內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，混勻，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，1／X2作為加權(quán)系數(shù)，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7.3 精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密量取空白血漿100 μL，加入低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液（分別含補(bǔ)骨脂素0.823 2、4.116 0、65.856 0 μg／mL，異補(bǔ)骨脂素0.482 4、2.412 0、38.592 0 μg／mL）各50 μL 及內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，作為質(zhì)控樣品，平行5份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2，可知均符合生物樣品分析要求。

表2 各成分準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.2 Results of accuracy and precision tests for various constituents（n＝5）

2.7.4 提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品各5份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算2種成分、內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)；另取空白血漿100 μL，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，上清液中加入上述質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，氮?dú)獯蹈?，?fù)溶，同法計(jì)算峰面積比值B；取上述質(zhì)量濃度對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液適量，同法計(jì)算峰面積比值C，測(cè)定提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)，公式分別為提取回收率＝（A／B）×100%、基質(zhì)效應(yīng)＝（B／C）×100%，結(jié)果見表3，可知血漿處理方法可行，無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)。

表3 各成分提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.3 Results of extraction recovery and matrix effect tests for various constituents（n＝5）

2.7.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品各5份，室溫放置4 h，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，考察室溫穩(wěn)定性；置于－20 ℃冰箱中冷凍保存12 h后，在室溫下自動(dòng)融化，反復(fù)操作3次，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，考察凍融穩(wěn)定性；在－20 ℃下放置30 d，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，考察長(zhǎng)期穩(wěn)定性；按 “2.5”項(xiàng)下方法處理，在－4 ℃下放置12 h 后再進(jìn)樣分析，考察處理后穩(wěn)定性，結(jié)果見表4，可知血漿在不同條件下穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求。2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究 血藥濃度?時(shí)間曲線見圖2，再采用DAS 3.2.8 軟件中的非房室模型計(jì)算Tmax、Cmax、AUC、T1／2、CLZ／F、MRT，SPSS 20.0 軟件對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表5～6。

表4 各成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.4 Results of stability tests for various constituents（n＝5）

圖2 各成分血藥濃度?時(shí)間曲線Fig.2 Plasma concentration?time curves for various constituents

由表5 可知，與模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅲ組比較，補(bǔ)骨脂丸組、模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅰ組補(bǔ)骨脂素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），Tmax延長(zhǎng)（P＜0.01），CLZ／F降低（P＜0.01），補(bǔ)骨脂丸組MRT0?∞延長(zhǎng)（P＜0.01）；模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅱ組補(bǔ)骨脂素CLZ／F降低（P＜0.05）。由表6 可知，與模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅲ組比較，補(bǔ)骨脂丸組、模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅰ組異補(bǔ)骨脂素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01），Tmax延長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01），CLZ／F降低（P＜0.01），補(bǔ)骨脂丸組MRT0?∞延長(zhǎng)（P＜0.01）；模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅱ組異補(bǔ)骨脂素AUC0～t升高（P＜0.01）。

表5 補(bǔ)骨脂素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for psoralen（，n＝6）

表5 補(bǔ)骨脂素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for psoralen（，n＝6）

注：與模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅲ組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表6 異補(bǔ)骨脂素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for isopsoralen（，n＝6）

表6 異補(bǔ)骨脂素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for isopsoralen（，n＝6）

注：與模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅲ組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論與結(jié)論

補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素是同分異構(gòu)體，兩者在脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征相似。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與補(bǔ)骨脂生品配伍的模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅱ、Ⅲ組比較，補(bǔ)骨脂鹽炙品配伍的補(bǔ)骨脂丸組、模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅰ組中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞更高，表明鹽炙能明顯促進(jìn)其吸收；與生補(bǔ)骨脂和生小茴香組成的模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅲ組比較，由鹽補(bǔ)骨脂和鹽小茴香組成的補(bǔ)骨脂丸組中上述2種成分Tmax、T1／2、MRT0～∞延長(zhǎng)，CLZ／F降低，表明鹽炙能減慢其代謝和消除速度，從而延長(zhǎng)藥效持續(xù)時(shí)間，提高生物利用度，與文獻(xiàn)［14］ 報(bào)道一致；與模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅰ、Ⅲ組比較，補(bǔ)骨脂丸組、模擬補(bǔ)骨脂丸Ⅱ組兩者吸收增加，代謝減慢，表明小茴香鹽炙后也會(huì)對(duì)其體內(nèi)吸收行為產(chǎn)生影響，即藥物鹽炙后配伍可改變其體內(nèi)吸收?？傊a(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素作為補(bǔ)骨脂主要成分，鹽炙后配伍可使兩者代謝減慢，作用時(shí)間延長(zhǎng)，吸收增強(qiáng)，可能是補(bǔ)骨脂丸中藥材如此處理后能增強(qiáng)溫腎暖脾止瀉作用的原因，同時(shí)也提示成分煎出量高低與其體內(nèi)吸收程度強(qiáng)弱未必呈正相關(guān)，可能是多種途徑作為增效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)來(lái)共同發(fā)揮藥效作用。

另外，采用劑量修正更能反映鹽在體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)層面對(duì)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的影響。但鹽在炮制、成分煎出過(guò)程中的影響（本實(shí)驗(yàn)所用鹽炙品均為自行炮制）也是補(bǔ)骨脂丸和3 種模擬補(bǔ)骨脂丸之間上述2 種成分藥動(dòng)學(xué)差異的影響因素，故本實(shí)驗(yàn)在繪制血藥濃度?時(shí)間曲線、計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)時(shí)未進(jìn)行劑量修正，以期客觀反映上述制劑藥動(dòng)學(xué)的差異。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法測(cè)定補(bǔ)骨脂丸中主要成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在脾腎陽(yáng)虛泄瀉模型大鼠血漿中的血藥濃度，分析由補(bǔ)骨脂和小茴香生品或鹽炙品組成的補(bǔ)骨脂丸、3 種模擬補(bǔ)骨脂丸中上述2 種成分的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征，并深入探討鹽炙后配伍對(duì)兩者體內(nèi)吸收的影響，可為揭示該制劑鹽炙增效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)提供有力的數(shù)據(jù)支撐。