張佩琛王濤

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 鄭州450064； 2.鄭州大學(xué)， 河南 鄭州450001）

金合歡素是一種黃酮類化合物，廣泛存在于洋槐樹、金合歡樹、密蒙花、菊花、大薊等植物的根莖中，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、心臟保護(hù)、抗骨質(zhì)疏松、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用［1?4］，但該成分溶解度僅為36.43 μg／mL［5］，會(huì)影響其溶出速率及溶出度，而且口服生物利用度僅為2.34%［6］，又會(huì)限制藥效發(fā)揮。胡瑞瑞等［7］制備了金合歡素聚乳酸納米粒，但其載藥量?jī)H為6.08%。

納米混懸劑無需載體材料即有較高的載藥量，并且藥物溶解度、溶出度、生物利用度、藥效等參數(shù)均可明顯改善［8?10］，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用潛力較大，工業(yè)化程度較高。因此，本實(shí)驗(yàn)將金合歡素制成納米混懸劑，采用Box?Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化該工藝，并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為該制劑后續(xù)開發(fā)利用提供參考。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ATS 型均質(zhì)機(jī)（德國 Seeker公司）；MSE125P?CE 型電子天平（配置防風(fēng)罩，德國Sartorius 公司）；HJ?2 磁力加熱攪拌器（青島創(chuàng)聚環(huán)保集團(tuán)有限公司）；Nano?S90 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；FD?1C?50 型實(shí)驗(yàn)室冷凍干燥機(jī)（上海賀帆儀器有限公司）；QIMO?DCY?12 S 型氮?dú)獯祾邇x（上海琪摩電子科技有限公司）。

金合歡素對(duì)照品（批號(hào)110981?201910，純度99.0%，中國食品藥品檢定研究院）；金合歡素原料藥（批號(hào)20191026，純度97%，成都嘉葉生物科技有限公司）。十二烷基磺酸鈉（SDS，批號(hào)171114，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯磺丙脲（批號(hào)200218，美國Sigma 公司）；PVP K30（批號(hào)190506）、泊洛沙姆188（批號(hào)181225）（安徽山河藥用輔料有限公司）。

SD 大鼠，體質(zhì)量（240±20）g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2016?0001，飼養(yǎng)于溫度、相對(duì)濕度分別為（25±2）℃、（45±5）%的環(huán)境下。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米混懸劑制備 取50 mg 金合歡素原料藥，加入30 mL 有機(jī)溶劑（四氫呋喃∶乙醇＝1∶1），65 ℃、1 000 r／min 磁力攪拌至溶解，作為有機(jī)相；稱取一定量PVP K30、SDS，加入100 mL 蒸餾水，65 ℃、1 000 r／min 磁力攪拌至溶解，作為水相，將有機(jī)相緩慢滴加到水相中，在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min 除去有機(jī)溶劑，在均質(zhì)壓力1 000 bar（1 bar＝100 kPa）下循環(huán)均質(zhì)數(shù)次，加入蒸餾水至100 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 粒徑測(cè)定 取0.1 mL 納米混懸劑，加入4 mL蒸餾水混勻，取適量至比色皿中，置于粒度分析儀中測(cè)定粒徑。

2.3 Box?Behnken 響應(yīng)面法 固定金合歡素用量為50 mg，穩(wěn)定劑為PVP K30、SDS 混合物，選擇PVP K30 占比（X1）、穩(wěn)定劑用量（X2）、均質(zhì)次數(shù)（X3）作為影響因素，粒徑（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Box?Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得二次多元回歸方程為Y＝214.62＋10.100X1－25.94X2－35.84X3＋19.38X1X2－46.93X1X3－5.55X2X3＋19.61＋71.39＋77.89，R2＝0.997 5，AdjR2＝0.994 2，表明模型擬合度良好，方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明未知因素干擾很小，模型可信度較高，可用于優(yōu)化；因素X2、X3、X1X2、X1X3、有極顯著影響（P＜0.01）。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

采用Design Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖1。由此可知，均質(zhì)次數(shù)不變時(shí)，隨著PVP K30 占比或穩(wěn)定劑用量增加，粒徑先減小后增大，可能是由于兩者不足時(shí)會(huì)影響穩(wěn)定效果，導(dǎo)致納米粒之間發(fā)生融合、聚集等現(xiàn)象，使得粒徑較大，但兩者過量時(shí)穩(wěn)定劑會(huì)吸附在納米顆粒表面，粒徑也會(huì)變大［10］；穩(wěn)定劑用量不變時(shí)，隨著均質(zhì)次數(shù)增加，粒徑先減小后增大，可能是由于均質(zhì)次數(shù)過少時(shí)不足以形成較小粒徑的納米混懸劑，但過多時(shí)會(huì)破壞納米粒穩(wěn)定劑保護(hù)層［8］，進(jìn)而發(fā)生融合、聚集等，導(dǎo)致粒徑變大；PVP K30 占比不變時(shí)，隨著均質(zhì)次數(shù)增加，粒徑先減小后增大，可能是由于均質(zhì)次數(shù)過多時(shí)納米混懸劑溫度較高［8］，影響了體系穩(wěn)定性，導(dǎo)致粒徑變大。最終確定，最優(yōu)工藝為PVP K30 占比47.16%，穩(wěn)定劑用量215.04 mg，均質(zhì)次數(shù)11.92次，粒徑為209.8 nm，為便于操作，將其修正為PVP K30 占比47%，穩(wěn)定劑用量215 mg，均質(zhì)次數(shù)12 次。

圖1 各因素響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

2.4 HPLC 法測(cè)定金合歡素含量

2.4.1 色譜條件 Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈?0.2% 磷酸（45∶55）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長268 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.4.2 線性關(guān)系考察 稱取金合歡素對(duì)照品10 mg至100 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解并定容，得100 μg／mL 貯備液，流動(dòng)相依次稀釋成20、10、1、0.5、0.1、0.05 μg／mL 對(duì)照品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝13.645 9X＋1.426 7（r＝0.999 9），在0.05～20 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 供試品溶液制備 取1 mL 納米混懸劑，置于50 mL 量瓶中，加入30 mL 甲醇超聲處理5 min，甲醇定容至刻度，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 方法學(xué)考察 取同一份納米混懸劑，按“2.4.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金合歡素峰面積RSD 為0.67%，表明該方法重復(fù)性良好。取同一份供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金合歡素峰面積RSD 為0.58%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取20、1、0.05 μg／mL 對(duì)照品溶液適量，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得金合歡素峰面積RSD 分別為0.36%、0.29%、0.44%，表明儀器精密度良好。取9 份供試品溶液，每份0.5 mL，平均分為3組，每組3份，分別加入“2.4.2”項(xiàng)下貯備液1.5、2.5、3.5 mL，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金合歡素平均加樣回收率分別為101.16%、99.27%、100.54%，RSD 分別為1.68%、0.61%、0.83%。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)及載藥量測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)下優(yōu)化工藝平行制備3 批納米混懸劑，分別取0.1 mL，加入4 mL 蒸餾水混勻，測(cè)定粒徑、Zeta 電位。結(jié)果，平均粒徑為214.7 nm（圖2），PDI 為0.094，Zeta 電位為－31.6 mV（圖3）。

圖2 金合歡素納米混懸劑粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of acacetin nanosuspensions

圖3 金合歡素納米混懸劑Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of acacetin nanosuspensions

取1 mL 納米混懸劑至50 mL 量瓶中，加入30 mL甲醇超聲處理5 min，甲醇定容至刻度，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算金合歡素含量（M2），平行3 次；另取1 mL，在－40 ℃下預(yù)凍48 h 后真空低溫凍干得粉末，稱定質(zhì)量（M1），平行3次，計(jì)算載藥量，公式為載藥量＝（M2／M1）×100%。結(jié)果，平均載藥量為18.77%。

2.6 凍干粉制備及表征

2.6.1 制備工藝 取納米混懸劑適量，加入6%甘露醇振蕩溶解，取3 mL 至西林瓶中，在－40 ℃下預(yù)凍48 h，迅速置于－20 ℃冷凍干燥機(jī)中抽真空，凍干48 h 后取出，即得，立即密封并置于干燥器中保存，外觀見圖4。取3 批凍干粉，蒸餾水復(fù)溶，測(cè)得其平均粒徑為248.14 nm。

圖4 凍干粉外觀Fig.4 Appearance of lyophilized powder

2.6.2 溶解度測(cè)定 取過量原料藥、物理混合物（PVP K30＋SDS，比例同最優(yōu)工藝）、納米混懸劑凍干粉適量置于燒杯中，加蒸餾水，室溫1 000 r／min磁力攪拌3 d，取上層混懸液，8 500 r／min 離心20 min，取上清液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算溶解度，結(jié)果見圖5。由此可知，物理混合物將原料藥溶解度提高至1.22倍，而納米混懸劑可提高至11.71 倍。

圖5 各樣品溶解度（n＝3）Fig.5 Solubilities of various samples（n＝3）

2.6.3 沉降體積比考察 取原料藥、物理混合物、納米混懸劑適量，置于50 mL 具塞量筒中，振蕩1 min，記錄初始高速（H0），再于室溫環(huán)境（溫度25 ℃、相對(duì)濕度55%）下靜置3 h，記錄最終高度（H），計(jì)算沉降體積比，公式為沉降體積比＝H／H0。結(jié)果，納米混懸劑未發(fā)生沉淀，沉降體積比為1，而原料藥、物理混合物均下降至0.62。

2.7 體外溶出研究 取原料藥、物理混合物、納米混懸劑凍干粉適量（以金合歡素計(jì)均為10 mg），加入4 mL 蒸餾水制成混懸液，置于活化后的透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），細(xì)尼龍繩將兩端扎緊，選擇900 mL 0.5%SDS 溶液作為溶出介質(zhì)，在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速100 r／min 條件下于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、9、12 h各取樣3 mL，同時(shí)補(bǔ)加3 mL 空白溶出介質(zhì)，過0.45 μm 水相微孔濾膜，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算溶出度，結(jié)果見圖6。由此可知，原料藥12 h 內(nèi)累積溶出度不足40%；物理混合物12 h 內(nèi)累積溶出度也僅提高至47.07%；納米混懸劑6 h 內(nèi)累積釋放度接近90%，12 h 內(nèi)達(dá)95.82%。

圖6 金合歡素體外溶出曲線（n＝3）Fig.6 In vitro dissolution curves for acacetin（n＝3）

2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.8.1 HPLC?MS 分析條件 ZORBAX SB C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈?0.1%甲酸（20∶80）；體積流量0.2 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；電噴霧離子源，負(fù)離子掃描；毛細(xì)管電壓3 000 V；霧化氣壓力30 psig（1 psig ＝68.194 8 kPa）；干燥氣體積流量8 L／min，溫度325 ℃；定量分析離子m／z285.22（金合歡素）、m／z277.60（氯磺丙脲，內(nèi)標(biāo)）。

2.8.2 分組、給藥及血漿處理 取原料藥、物理混合物、納米混懸劑凍干粉末適量，制成0.5%CMC?Na 混懸液，作為灌胃液（以金合歡素計(jì)，質(zhì)量濃度為7 mg／mL）。取18 只禁食12 h 的大鼠，隨機(jī)分為3組，每組6只，按50 mg／kg 劑量灌胃給藥。乙醚麻醉大鼠后，原料藥組于0、0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4 h 采血，物理混合物組增加5 h 取血點(diǎn)，納米混懸劑組增加5、6、8 h取血點(diǎn)，分別取約0.2 mL，置于肝素化離心管中，3 000 r／min 離心3 min，得含藥血漿，吸取50 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液（將含100 μg／mL 乙腈的氯磺丙脲對(duì)照品母液用乙腈稀釋至400 ng／mL，即得）、1.5 mL 乙腈，密封渦旋6 min，8 000 r／min離心5 min，取上層有機(jī)相，45 ℃氮?dú)饩徛蹈?，加?0 μL 甲醇超聲處理3 min，進(jìn)樣分析。

2.8.3 線性關(guān)系考察 取500 ng／mL 對(duì)照品溶液，乙腈逐步稀釋至250、200、100、50、10 ng／mL，分別取50 μL，45 ℃氮?dú)饩徛蹈?，加?0 μL 空白血漿，密封渦旋6 min，即得血漿對(duì)照品溶液，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），金合歡素、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.057 1X＋0.305 4（r＝0.994 2），在10～500 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.4 專屬性考察 取空白血漿、內(nèi)標(biāo)＋灌胃給藥4 h 后血漿、內(nèi)標(biāo)＋血漿對(duì)照品溶液（10 ng／mL）適量，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖7。由此可知，金合歡素色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度理想，表明該方法專屬性良好。

圖7 金合歡素提取離子流色譜圖Fig.7 Extraction ion current chromatograms of acacetin

2.8.5 方法學(xué)考察 取10、200、500 ng／mL 質(zhì)控樣品溶液適量，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積（ρ1）；取50 μL 空白血漿，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理（不加內(nèi)標(biāo)）得殘?jiān)?，加?0、200、500 ng／mL對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣 測(cè)定，計(jì)算峰面積（ρ2）；取 10、200、500 ng／mL質(zhì)控樣品溶液（不按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理），在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積（ρ3），根據(jù)公式（ρ2／ρ3）×100% 計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，（ρ1／ρ2）×100%計(jì)算提取回收率，結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度金合歡素基質(zhì)效應(yīng)分別為96.15%、93.27%、94.55%，提取回收率分別為90.69%、94.74%、89.07%，而內(nèi)標(biāo)兩者分別為95.17%、93.21%，表明該方法基質(zhì)效應(yīng)較小。取灌胃給藥1 h后血漿，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.8.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金合歡素、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD 為11.01%，表明血漿在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取10、200、500 ng／mL 血漿對(duì)照品溶液，同一天內(nèi)在“2.8.1”項(xiàng)條件下各進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得金合歡素、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD分別為9.61%、6.28%、8.17%，表明日內(nèi)精密度良好，再根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算金合歡素含量，測(cè)得其準(zhǔn)確度分別為107.52%、95.38%、103.91%；同法每天各測(cè)定6次，連續(xù)6 d，測(cè)得兩者比值RSD 分別為11.73%、8.64%、9.84%，表明日間精密度良好，準(zhǔn)確度分別為103.66%、108.92%、97.16%。

2.8.6 結(jié)果分析 采用實(shí)測(cè)值計(jì)算tmax、Cmax，梯形法計(jì)算AUC，結(jié)果見表4，血藥濃度?時(shí)間曲線見圖8。由此可知，與原料藥比較，物理混合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05），表明輔料增溶作用促進(jìn)了藥物吸收，但作用有限，相對(duì)生物利用度僅提高至1.33 倍；納米混懸劑tmax縮短（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升 高（P＜0.01），相對(duì)生物利用度提高至5.18倍，程度遠(yuǎn)大于物理混合物。

表4 金合歡素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for acacetin（，n＝6）

表4 金合歡素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for acacetin（，n＝6）

注：與金合歡素比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

圖8 金合歡素血藥濃度?時(shí)間曲線（n＝6）Fig.8 Plasma concentration?time curves for acacetin（n＝6）

3 討論

PVP K30 與SDS 聯(lián)合應(yīng)用作為穩(wěn)定劑時(shí)，納米混懸劑粒徑較小，可能是由于前者黏度較大，可有效抑制納米粒子的碰撞，并且分子鏈較長，提供了較大的空間位阻效應(yīng)［11?13］；后者是一種陰離子表面活性劑，可有效降低界面張力，有利于在制備過程中降低粒徑［11］，但穩(wěn)定劑總用量、PVP K30 占比對(duì)粒徑影響較大，故結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者（100～300 mg、30%～70%）進(jìn)行優(yōu)化。另外，均質(zhì)壓力過小或過大均會(huì)導(dǎo)致粒徑變大，故本實(shí)驗(yàn)在均質(zhì)壓力100 000 kPa 的前提下對(duì)均質(zhì)次數(shù)（5～15 次）進(jìn)行優(yōu)化。

據(jù)文獻(xiàn)［2?3］ 報(bào)道，大鼠口服金合歡素劑量為10～80 mg／kg時(shí)即有明顯的神經(jīng)保護(hù)、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，故本實(shí)驗(yàn)選擇50 mg／kg進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。結(jié)果，金合歡素納米混懸劑大大降低了藥物粒徑，藥物溶出速率明顯提高［13?14］，導(dǎo)致tmax顯著縮短，Cmax升高，可能與該劑型可有效改善藥物溶解度、累積溶出度有關(guān)［15?16］。研究表明，納米混懸劑可增加藥物比表面積，有利于其充分吸收［17?20］；納米藥物具有較強(qiáng)的胃腸道滲透性［17］，可增加經(jīng)胞間、淋巴循環(huán)等途徑進(jìn)入血液循環(huán)［21］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將金合歡素制成納米混懸劑后生物利用度提高至5.18 倍。今后，將對(duì)金合歡素納米混懸劑的注射藥動(dòng)學(xué)、毒性、藥效學(xué)等指標(biāo)作進(jìn)一步研究。