刁春玲 鄧杰華 袁秀澤 朱建蒙 楊建冬 周云峰

（1.淳安縣第一人民醫(yī)院， 浙江 杭州311700； 2.宜春市食品藥品檢驗(yàn)所， 江西 宜春336000）

附子是毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.子根的加工品，具有補(bǔ)火助陽(yáng)、回陽(yáng)救逆功效［1］，臨床作用顯著，但毒性較強(qiáng)，使用不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致中毒甚至死亡［2?3］，其有效成分和有毒物質(zhì)均為二萜類生物堿，其中雙酯型生物堿毒性最強(qiáng)［4］，包括烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿［5?7］，故需經(jīng)過(guò)炮制加工成飲片來(lái)減低毒性后才能使用，但不同方法效果有所差異［8?10］，不能保證完全去除該類成分，導(dǎo)致潛在風(fēng)險(xiǎn)一直存在。

右歸丸中含有炮附片［11］，它作為附子炮制飲片可能會(huì)引入雙酯型生物堿，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是采用TLC 法對(duì)烏頭堿含量進(jìn)行限制［11］，但樣品前處理過(guò)程復(fù)雜繁瑣，判定依據(jù)也只是與對(duì)照品比較斑點(diǎn)大小，專屬性不強(qiáng)，而且部分雙酯型生物堿的限量控制并不能完全消除安全風(fēng)險(xiǎn)，目前也無(wú)關(guān)于對(duì)該制劑毒性物質(zhì)評(píng)價(jià)的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC?MS／MS）法同時(shí)測(cè)定右歸丸中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿3 種雙酯型生物堿的含量，并對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，以期為其他中藥復(fù)方制劑安全性評(píng)價(jià)及有害物質(zhì)限度控制研究提供依據(jù)。

1 材料

Waters ACQUITY UPLC H?class／xevo TQD 液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司）；LE204E 電子天平（萬(wàn)分之一）、MS205DU 電子天平（十萬(wàn)之一）［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；PL?S60 超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。右歸丸（小蜜丸）共12批，由仲景宛西制藥股份有限公司提供。新烏頭堿（批號(hào)17011302，純度98%）、烏頭堿（批號(hào)17022702，純度98%）、次烏頭堿（批號(hào)17072103，純度98%）對(duì)照品均購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈（德國(guó)默克公司）；甲酸［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.1% 甲酸（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；樣品室溫度10 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子檢測(cè)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；脫溶劑氣溫度600 ℃，體積流量1 000 L／h；錐孔氣體積流量50 L／h，其他參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 各雙酯型生物堿質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrum parameters for various diester alkaloids

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，50% 甲醇（含0.1% 鹽酸）溶解，制成含烏頭堿166.600 ng／mL、次烏頭堿219.520 ng／mL、新烏頭堿161.500 ng／mL 的貯備液，分別精密量取1、5、10、15、25 mL，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇（含0.1%鹽酸）溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液 本品用粉碎機(jī)打碎后取約2.5 g，精密稱定，置于250 mL 錐形瓶中，精密加入50%甲醇（含0.1%鹽酸）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，振搖5 min，常溫超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，50%甲醇（含0.1%鹽酸）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 取不含炮附片的本品約2.5 g 作為陰性樣品，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.4 空白溶液 不加本品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度貯備液各5 μL，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，以信噪比（S／N）3∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表3，可知各雙酯型生物堿在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各雙酯型生物堿線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various diester alkaloids

2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品（批號(hào)190502）、陰性樣品、空白溶液各5 μL，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品溶液出現(xiàn)與對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰，而且提取的各離子對(duì)均有較高響應(yīng)，保留時(shí)間也基本相同，同時(shí)陰性樣品、空白溶液均無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰，對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各雙酯型生物堿MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various diester alkaloids

2.6 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一份對(duì)照品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD 分別為0.9%、0.4%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品（批號(hào)190502）6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD 分別為4.5%、3.1%、3.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批本品（批號(hào)190502），于0、1、2、4、8、12 h 在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積RSD 分別為3.4%、1.6%、2.2%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取各雙酯型生物堿含量已知的本品（批號(hào)190502）約1.25 g，精密稱定，置于250 mL 錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（含烏頭堿69.2 ng／mL、次烏頭堿485.2 ng／mL、新烏頭堿257.6 ng／mL）5 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4，可知均符合2020 年版《中國(guó)藥典》四部［12］要求。

表4 各雙酯型生物堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various diester alkaloids（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定 取12 批樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下各進(jìn)樣測(cè)定2次，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各雙酯型生物堿含量測(cè)定結(jié)果（μg／g，n＝2）Tab.5 Results of content determination of various diester alkaloids（μg／g，n＝2）

2.9 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià) 12 批樣品均存在烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿3 種雙酯型生物堿，具有心血管系統(tǒng)［13?14］、神經(jīng)系統(tǒng)［15?16］、生殖［17?18］、胚胎［19］、肝腎［20］毒性，故有必要對(duì)三者風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2020 年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定，炮附片含雙酯型生物堿以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總量計(jì)，不得超過(guò)0.020%（200 μg／g），其一次服用量為3～15 g，則最大耐受總量為3 000 μg。右歸丸中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總量范圍為2.346～3.241 μg／g，其一次服用量為9 g，則人體最大攝入量為29.169 μg，小于最大耐受總量，表明三者風(fēng)險(xiǎn)較小。

半數(shù)致死量（LD50）可衡量藥物安全性，反映急性毒性強(qiáng)弱［21］，烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的小鼠LD50分別為1.8、5.8、1.9 μg／g，而國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)成人體質(zhì)量為55.9 kg，則折算成三者引起成人急性中毒量分別為100.620、324.220、106.210 mg。服用右歸丸后，進(jìn)入人體的上述3 種雙酯型生物堿最大總量?jī)H為29.169 μg，即不會(huì)構(gòu)成急性中毒風(fēng)險(xiǎn)。

在3 種雙酯型生物堿中，烏頭堿毒性最強(qiáng)，成人口服0.2 mg 即可中毒，3～5 mg 即可致死［22］。以0.2 mg 為口服中毒閾值，測(cè)得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿口服最大總量為29.169 μg，小于該閾值，表明三者產(chǎn)生安全風(fēng)險(xiǎn)的概率較低。

3 討論

烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿既是有效成分，又是毒性物質(zhì)，其治療劑量與中毒劑量接近，臨床治療窗較窄［23?24］，易產(chǎn)生安全風(fēng)險(xiǎn)，故有必要對(duì)三者進(jìn)行限量控制。中成藥處方藥味較多，成分組成復(fù)雜，如僅采用1 個(gè)離子對(duì)進(jìn)行MRM 定量檢測(cè)時(shí)，分子結(jié)構(gòu)式類似者易產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致假陽(yáng)性，故需先對(duì)其進(jìn)行定性鑒別。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一、二級(jí)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，各批次右歸丸均存在與烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對(duì)照品相應(yīng)的碎片離子，即均含有上述3 種毒性物質(zhì)，再選取3 個(gè)以上響應(yīng)較高者進(jìn)行MRM 定量測(cè)定。

雙酯型生物堿會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，加熱時(shí)其含量下降更快［25］，故對(duì)該類成分進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)需考慮上述情況。右歸丸屬于蜜丸，具有黏性，難以研成細(xì)粉，故本實(shí)驗(yàn)考察了水、0.1% 鹽酸、甲醇（含0.1%鹽酸）、50%甲醇（含0.1%鹽酸）等溶劑，以及常溫超聲處理30 min、過(guò)夜浸泡、過(guò)夜浸泡后再常溫超聲處理30 min 等提取方法對(duì)烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量的影響，最終確定為50%甲醇（含0.1%鹽酸）、常溫超聲處理30 min。

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC?MS／MS 法同時(shí)測(cè)定右歸丸中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿3 種雙酯型生物堿的含量，發(fā)現(xiàn)市售樣品中三者均較低，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)顯示安全性較高，不易產(chǎn)生中毒風(fēng)險(xiǎn)。因此，有關(guān)企業(yè)在生產(chǎn)含附子的藥品時(shí)需加強(qiáng)質(zhì)量管理和風(fēng)險(xiǎn)把控，嚴(yán)格控制雙酯型生物堿含量，保證原料藥材和飲片質(zhì)量，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，以期從源頭上減少該類成分帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn)。