唐今揚(yáng) 周彩云王鑫馬芳潘崢 韓淑花李斌 杜麗妍程國(guó)良 房定亞?

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院風(fēng)濕病科， 北京100091； 2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 臨沂276000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種累及周圍關(guān)節(jié)為主的炎癥性自身免疫病，影響全球0.5%～1.0%人口［1］，我國(guó)大陸地區(qū)發(fā)病率為0.42%［2］，是造成人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘的主要病因之一。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制涉及多種免疫活性細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，是一個(gè)多因素參與、多通路累及的過程［3?4］。金藤清痹顆粒是中藥六類新藥，具有清熱解毒、活血消腫、通痹止痛等功效，主治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期，具有抗炎、止痛、解熱和免疫調(diào)節(jié)作用［5］。臨床研究表明，金藤清痹顆粒可以明顯改善活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀、體征以及各項(xiàng)生化指標(biāo)，療效確切［6?8］，但其作用機(jī)制目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過注射牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，評(píng)價(jià)金藤清痹顆粒對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用，并探索其對(duì)于免疫微環(huán)境的影響，從而為金藤清痹顆粒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar 大鼠，雌雄各半，9 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018?0004。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～24 ℃，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 金藤清痹顆粒（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20123065，批號(hào)28180031，魯南厚普制藥有限公司）。弗氏不完全佐劑、蘇木素（貨號(hào)F5506、H9627，美 國(guó)Sigma 司）；牛Ⅱ型膠原（批號(hào)20021，美 國(guó) Chondrex公司）；TRIzol（貨號(hào)252250AX，北京艾德萊生物科技有限公司）；HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）、SYBR Green Master Mix（貨號(hào)R101?01／02、Q111?02，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；磷酸酶抑制劑、RIPA 裂解液（貨號(hào)S1873、BP0013，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；胞漿胞核蛋白提取試劑盒（貨號(hào)KGP150，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；GAPDH 抗體（貨號(hào)AB?P?R 001，杭州賢至生物科技有限公司）；LaminB 抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（貨號(hào)BA1228、BA1054，武漢博士德生物工程有限公司）；IκBα 抗體（貨號(hào)Bs?1287r，天津速?gòu)粕锟萍加邢薰荆籶?IκBα（SER32）抗體（貨號(hào)2859，美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；IKKβ 抗體（貨號(hào)AF6009，美國(guó)Affinity 公司）；p65抗體、TLR4抗體（貨號(hào)10745?1?AP、19811?1?AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；ECL底物液（貨號(hào)P1050，北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；FITC ANTI?RAT CD4（貨號(hào)201505，美國(guó)BioLegend 公司）；ANTI?MO／RT IL?17A PE（貨號(hào)12?7177?81，美國(guó)Invitrogen 公司）；伊紅Y（水溶性）（貨號(hào)71014544，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。無水乙醇、二甲苯（貨號(hào) 10009218、010023418，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器 Scientific 8000 型CO2培養(yǎng)箱、ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；BH2 型熒光顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus 公司；FACSVerse 型流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)BD 公司；imark 酶標(biāo)儀、電泳儀，購(gòu)自美國(guó)Bio?Rad 公司。

1.4 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型建立 在無菌條件下，利用均質(zhì)儀將牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑按1∶1比例（體積比）充分乳化，形成膠原乳劑，牛Ⅱ型膠原的終質(zhì)量濃度為1 mg／mL。每只大鼠于尾根部、背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.3 mL 膠原乳劑，正常組大鼠在相同部位注射等體積溶劑，建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）模型，第7 天后，按照原方法于大鼠尾根部注射0.2 mL 膠原乳劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫1次，正常組注射等體積溶劑，共造模14 d，關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分≥4 分視為造模成功。

1.5 分組及給藥 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、甲氨蝶呤組、雷公藤多苷組及金藤清痹顆粒低、中、高劑量組，每組10只，另以10 只正常大鼠為正常組。金藤清痹顆粒低、中、高劑量組灌胃給予1.05、2.1、4.2 g／kg 金藤清痹顆粒溶液（0.9%氯化鈉注射液配制），每天3 次；甲氨蝶呤組灌胃給予0.8 mg／kg 甲氨蝶呤片，每4 d 給藥1次，其余時(shí)間灌胃給予等量0.9% 氯化鈉注射液；雷公藤多苷組灌胃給予7.875 mg／kg 雷公藤多苷片，該劑量分3 次給予；模型組和正常組灌胃給予等量0.9% 氯化鈉注射液，連續(xù)給藥4 周（15～42 d）。各組存活大鼠均隨機(jī)選取6 只進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.6 大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹變化的測(cè)定 于第0、7、14、21、28、35、42 天檢測(cè)各組大鼠左后肢關(guān)節(jié)腫脹足底厚度，腫脹度＝［（dt－d0）／d0］ ×100%，其中d0為造模前的足底厚度，dt為造模后的足底厚度。

1.7 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 于第0、7、14、21、28、35、42 天對(duì)每只大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)為0分，足底厚度無關(guān)節(jié)炎；1分，輕微癥狀，但踝關(guān)節(jié)或腕出現(xiàn)紅腫等現(xiàn)象；2分，踝關(guān)節(jié)或腕中度紅腫現(xiàn)象；3分，整個(gè)爪包括趾（指）在內(nèi)都嚴(yán)重紅腫；4分，關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹并伴有功能障礙。大鼠四肢分別所得的評(píng)分累加起來，即為每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

1.8 免疫組化染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞 給藥4 周后（42 d），取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋后切片。組織切片脫蠟后放入0.01 mol／L 枸櫞酸緩沖液中，采用電陶爐加熱對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫室溫孵育15 min，正常山羊血清室溫封閉30 min，加入一抗后4 ℃濕盒中孵育過夜，PBS 沖洗切片后滴加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育20 min，按試劑盒說明書進(jìn)行顯色，復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17、Treg 細(xì)胞比例 給藥4 周后（42 d），大鼠腹股溝動(dòng)脈取血，Percoll 非連續(xù)性密度梯度離心法獲得外周血單核細(xì)胞，加入20 ng／mL 丙二醇甲醚醋酸酯、1 μg／mL 鈣離子載體、2 μmol／L 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育5 h，PBS 洗滌后重懸，加入一抗（CD4?FITC、CD25?APC）4 ℃避光孵育30 min，加入Fix／Perm Buffer 4 ℃孵育50 min，加入Perm／Wash Buffer 清洗后重懸，加入一抗（FOXP3?PE）4 ℃避光孵育30 min，離心后PBS 重懸，流式儀上機(jī)檢測(cè)。

1.10 HE 觀察膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化 取“1.8”項(xiàng)下切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟后，放入蘇木素染液中染色5 min，自來水沖洗，放入1%鹽酸乙醇中分化2～5 s，自來水沖洗，放入1%伊紅染液中染色1 min，自來水沖洗30 s，再經(jīng)梯度乙醇和二甲苯脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。從每個(gè)高倍視野觀察的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織增生、纖維組織增生3 個(gè)方面病理表現(xiàn)進(jìn)行綜合評(píng)判。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為①炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為0 分；少于20 個(gè)為1 分；20～50 個(gè)為2 分；大于50 個(gè)為3 分。②纖維組織增生，無纖維組織增生為0 分；平均增生少于0.2 個(gè)為1 分；0.2～0.4個(gè)為2 分；大于0.4 個(gè)為3 分。③滑膜細(xì)胞增生，滑膜細(xì)胞扁平，數(shù)量不多為0 分；滑膜細(xì)胞腫脹，密集單層排列為1 分；滑膜細(xì)胞腫脹，密集2 層排列為2 分；滑膜細(xì)胞腫脹，密集3 層以上排列為3 分。

1.11 Western blot 法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、IKKβ、p?IκBα、IκBα、p65 蛋白表達(dá) 取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，使用RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解組織提取蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS?PAGE 凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，經(jīng)封閉液封閉后使用TLR4、IKKβ、p?IκBα、IκBα、p65 一抗孵育，然后使用HRP 結(jié)合二抗孵育，最后通過ECL 發(fā)光液顯影并拍照。細(xì)胞核p65 蛋白以Lamin B1 為內(nèi)參，其余蛋白以GAPDH 為內(nèi)參，通過分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.12 RT?qPCR 法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、IKKβmRNA 表達(dá) 取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，使用TRIzol 試劑從組織中提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 濃度，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過ABI 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行RT?qPCR 實(shí)驗(yàn)，以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法計(jì)算TLR4、IKKβ相對(duì)mRNA 表達(dá)。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，TLR4 正向序列5′?TGGTGGCTGTGGAGAC AAAAATGAC?3′，反向序列5′?CTGAAAGGCTTGG GCTTGAATGGAG?3′；IKKβ正向序列5′?CAGAATC CTGACCTGGTCTCGC?3′，反向序列5′?CACAGTCA TCGTAGGGCAACTCATC?3′；GAPDH正向序列5′?ACAGCAACAGGGTGGTGGAC?3′，反向序列5′?TTT GAGGGTGCAGCGAACTT?3′。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方（χ2）檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金藤清痹顆粒對(duì)CIA 大鼠左后肢腫脹的影響 如圖1、表1 所示，7、14、21、28、35、42 d時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠左后肢腫脹度增加（P＜0.01）；21、28 d時(shí)，與模型組比較，金藤清痹顆粒高劑量組、甲氨蝶呤組和雷公藤多苷組大鼠左后肢腫脹度降低（P＜0.05，P＜0.01）；35、42 d時(shí)，與模型組比較，各給藥組大鼠左后肢腫脹度均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠左后肢腫脹情況Fig.1 Left hind limbs swelling in rats of each group

表1 各組大鼠左后肢腫脹度比較（%，，n＝10）Tab.1 Comparison of left hind limb swelling degree in rats of each group（%，，n＝10）

表1 各組大鼠左后肢腫脹度比較（%，，n＝10）Tab.1 Comparison of left hind limb swelling degree in rats of each group（%，，n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

2.2 金藤清痹顆粒對(duì)CIA 大鼠左后肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 如表2 所示，與模型組比較，21 d時(shí)，金藤清痹顆粒高劑量組和雷公藤多苷組大鼠左后肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低（P＜0.05，P＜0.01）；28、35、42 d時(shí)，各給藥組大鼠左后肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各組大鼠左后肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（分，，n＝10）Tab.2 Comparison of arthritis severity scale of left hind limb in rats of each group（score，，n＝10）

表2 各組大鼠左后肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（分，，n＝10）Tab.2 Comparison of arthritis severity scale of left hind limb in rats of each group（score，，n＝10）

注：與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

2.3 金藤清痹顆粒對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)的影響 如圖2 所示，正常組大鼠滑膜細(xì)胞無明顯增生現(xiàn)象，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無血管翳形成；與正常組比較，模型組大鼠滑膜細(xì)胞腫脹，密集排列，滑膜細(xì)胞增生明顯，細(xì)胞間隙可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜組織有大量血管增生；與模型組比較，金藤清痹顆粒低劑量組大鼠滑膜細(xì)胞增生有所下降，有明顯血管增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而金藤清痹顆粒中、高劑量組及甲氨蝶呤組、雷公藤多苷組大鼠滑膜細(xì)胞增生有較大程度下降，細(xì)胞間可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生不顯著，滑膜組織中有少量血管增生。如表3 所示，與模型組比較，各給藥組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理?yè)p傷評(píng)分均降低（P＜0.01），且金藤清痹顆粒的作用呈劑量依賴性。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理?yè)p傷評(píng)分比較（分，，n＝6）Tab.3 Comparison of pathological damage score of rat knee joint synovium of each group（score，，n＝6）

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理?yè)p傷評(píng)分比較（分，，n＝6）Tab.3 Comparison of pathological damage score of rat knee joint synovium of each group（score，，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)（HE，×200）Fig.2 Pathological morphology of rat knee synovial tissue of each group（HE，×200）

2.4 金藤清痹顆粒對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響 CD68 為巨噬細(xì)胞表面分子，巨噬細(xì)胞分為M1 型和M2型，CD86 為M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，CD206 為M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物。如圖3～5、表4 所示，與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織CD68、CD86 表達(dá)升高（P＜0.01），CD206 表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠滑膜組織CD68、CD86 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），CD206 表達(dá)升高（P＜0.01），且金藤清痹顆粒的作用呈劑量依賴性。

表4 各組大鼠滑膜組織CD68、CD86、CD206 表達(dá)比較（，n＝6）Tab.4 Comparison of CD68，CD86 and CD206 expressions in rat synovial tissues of each group（，n＝6）

表4 各組大鼠滑膜組織CD68、CD86、CD206 表達(dá)比較（，n＝6）Tab.4 Comparison of CD68，CD86 and CD206 expressions in rat synovial tissues of each group（，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖3 各組大鼠滑膜組織CD68 免疫組化染色圖（×400）Fig.3 Immunohistochemical staining of CD68 in rat synovial tissue of each group（×400）

圖4 各組大鼠滑膜組織CD86 免疫組化染色圖（×400）Fig.4 Immunohistochemical staining of CD86 in rat synovial tissue of each group（×400）

圖5 各組大鼠滑膜組織CD206 免疫組化染色圖（×400）Fig.5 Immunohistochemical staining of CD206 in rat synovial tissue of each group（×400）

2.5 金藤清痹顆粒對(duì)大鼠外周血Th17、Treg 細(xì)胞比例的影響 如圖6～7、表5 所示，與正常組比較，模型組大鼠外周血Th17 細(xì)胞比例、Th17／Treg比例升高（P＜0.01），Treg 細(xì)胞比例降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠外周血Th17 細(xì)胞比例、Th17／Treg 比例降低（P＜0.01），Treg 細(xì)胞比例升高（P＜0.05，P＜0.01），且金藤清痹顆粒的作用呈劑量依賴性。結(jié)果表明，造模后大鼠Th17／Treg 比例升高，促進(jìn)炎癥的發(fā)生；金藤清痹顆粒、甲氨蝶呤和雷公藤多苷均能改善大鼠Th17／Treg 比例，抑制炎癥反應(yīng)，且高劑量金藤清痹顆粒作用優(yōu)于低、中劑量。

圖6 各組大鼠外周血中Th17 細(xì)胞比例Fig.6 Proportions of Th17 cells in rat peripheral blood of each group

表5 各組大鼠外周血中Th17、Treg 細(xì)胞比例比較（，n＝6）Tab.5 Comparison of the proportions of Th17 and Treg cells in rat peripheral blood of each group（，n＝6）

表5 各組大鼠外周血中Th17、Treg 細(xì)胞比例比較（，n＝6）Tab.5 Comparison of the proportions of Th17 and Treg cells in rat peripheral blood of each group（，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖7 各組大鼠外周血中Treg 細(xì)胞比例Fig.7 Proportions of Tregs in rat peripheral blood of each group

2.6 金藤清痹顆粒對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4／NF?κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖8 所示，與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織中TLR4、p?IκBα 和細(xì)胞核p65 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），IKKβ 和胞質(zhì)p65 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TLR4、p?IκBα 和細(xì)胞核p65蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），IKKβ 和胞質(zhì)p65 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），且金藤清痹顆粒的作用呈劑量依賴性。

圖8 各組大鼠滑膜組織TLR4／NF?κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（，n＝6）Fig.8 Comparison of TLR4／NF?κB signaling pathway related proteins expression in rat synovial tissues of each group（，n＝6）

2.7 金藤清痹顆粒對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、IKKβmRNA 表達(dá)的影響 如圖9 所示，與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織中TLR4 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），IKKβmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TLR4 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），IKKβmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖9 各組大鼠滑膜組織TLR4、 IKKβ mRNA 表達(dá)比較（，n＝6）Fig.9 Comparison of TLR4 and IKKβ mRNA expressions in rat synovial tissues of each group（，n＝6）

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的基本病理改變?yōu)榛ぜ?xì)胞增生，襯里層增厚，多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管形成，侵蝕軟骨與骨組織，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失［9］。Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)研究常用的經(jīng)典動(dòng)物模型，其關(guān)節(jié)癥狀和病理表現(xiàn)與人類的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相似。本研究發(fā)現(xiàn)，金藤清痹顆粒和甲氨蝶呤以及雷公藤多苷均不同程度減輕了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜増生、血管新生等類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理?yè)p傷。

免疫功能紊亂及免疫微環(huán)境的改變是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制和重要環(huán)節(jié)。CD4＋T 細(xì)胞被認(rèn)為在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中起著關(guān)鍵性的作用，它至少有4 個(gè)不同的亞群，即Th1、Th2、Th17 和Treg 細(xì)胞，其中Th1 和Th17 細(xì)胞具有促炎作用，而Th2 和Treg 細(xì)胞有抑炎作用［10?12］。Th17與Treg 在發(fā)育和功能上相互拮抗，Th17／Treg 之間的平衡在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［13?14］，調(diào)控其平衡可成為防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要策略［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，CIA 模型大鼠外周血Th17 比例升高，而Treg 比例降低；金藤清痹顆粒、甲氨蝶呤和雷公藤多苷均能降低Th17 比例并升高Treg 比例，最終降低Th17／Treg 比值。

巨噬細(xì)胞來源于骨髓的單核細(xì)胞，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中下層巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加是病情活動(dòng)的早期特征，且巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度與關(guān)節(jié)侵蝕程度密切相關(guān)，從炎癥組織中清除這些巨噬細(xì)胞具有潛在的治療作用［16］。同時(shí)，巨噬細(xì)胞分為M1 型和M2 型2類，M1 型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，引起關(guān)節(jié)損傷；M2 型巨噬細(xì)胞釋放抗炎細(xì)胞因子，抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［17］。研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者存在巨噬細(xì)胞活化與M1／M2 比例失衡，外周血呈現(xiàn)M1 和M2 混合型，而關(guān)節(jié)腔積液呈現(xiàn)M1 型［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，CIA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜總巨噬細(xì)胞及M1 型巨噬細(xì)胞增加，而M2 型巨噬細(xì)胞減少，M1／M2 巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)失衡；金藤清痹顆粒、甲氨蝶呤和雷公藤多苷均可以使滑膜總巨噬細(xì)胞數(shù)減少，且均能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞失衡的極化狀態(tài)趨于正常。

TLR4 是一種模式識(shí)別受體，與慢性炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病密切相關(guān)，NF?κB 是TLR4 下游炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子，主要由p65 和p50 結(jié)合形成二聚體或異二聚體，具有明顯的促炎活性［19?20］。IκBα 是IκB 家族中的一員，是NF?κB 的主要抑制劑。當(dāng)細(xì)胞外刺激發(fā)生時(shí)，TLR4 信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)首先激活I(lǐng)KB 激酶復(fù)合物，使IKB 發(fā)生磷酸化并降解，從NF?κB 中解離，使p65 活化并從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與炎癥基因相結(jié)合，啟動(dòng)炎癥因子轉(zhuǎn)錄，釋放促炎因子。本研究發(fā)現(xiàn)，金藤清痹顆粒、甲氨蝶呤和雷公藤多苷均降低TLR4、p?IκBα和細(xì)胞核p65 蛋白表達(dá)，升高IKKβ 和胞質(zhì)p65 蛋白表達(dá)，降低TLR4 mRNA 表達(dá)，并升高IKKβmRNA 表達(dá)，說明金藤清痹顆粒能夠抑制TLR4／NF?κB 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用。