葛珈銘鄧莎趙盈 遲凱文 李佳榮 李夢園 李先寬

（天津中醫(yī)藥大學(xué)， 天津301617）

干蟾為兩棲綱蟾蜍屬動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍Bufo MelanostictusSchneider 除去內(nèi)臟的干燥體，首載于 《本經(jīng)逢原》［1］，性味辛涼，有毒，具有消腫解毒、利尿之功效，其水溶液制劑具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等作用［2?4］，臨床上用于治療帶狀皰疹、肺癌、肝癌、胃癌、惡性腫瘤等疾?。??9］。目前，隨著市場需求不斷增加，蟾蜍在許多省份均有養(yǎng)殖，但并未形成規(guī)范統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［10?11］，導(dǎo)致市場上干蟾皮質(zhì)量參差不齊。本研究以刮漿后的干蟾為研究對象，對不同生長年限干蟾中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈4 種指標(biāo)成分進行測定，旨在對不同生長年限的干蟾進行質(zhì)量評價，并探究干蟾成分累積與生長年限等因素的關(guān)系，為干蟾的規(guī)范化生產(chǎn)，蟾蜍類藥材資源高效利用提供依據(jù)。

1 材料

LC?20AT 型 HPLC 儀（日本島津公司）；KH3200B 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器公司）；FA2004 萬分之一電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；Sartorius BT125D 十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE?52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KDM 型調(diào)溫電熱套（北京永興精佳儀器有限公司）。

蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111981?201501、110718?201108、110803?201406）；蟾毒它靈對照品（天津萬象恒遠科技有限公司，批號20180115）。乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；磷酸二氫鉀（分析純，批號20141218）；磷酸（分析純）；重蒸餾水。

4 批干蟾均購自吉林市昌邑區(qū)某蟾蜍養(yǎng)殖合作社，加工方式均為蟾蜍刮漿，腹部切開，剝?nèi)∑?，保留頭、足、骨骼，玻璃板上及時展開晾干，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張堅副教授鑒定為中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 的干燥全體，見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相乙腈（A）?0.5%磷酸二氫鉀（B），磷酸調(diào)節(jié)pH 為3.2，梯度洗脫（0～15 min，30%～61% B；15～30 min，61% B；30～32 min，30% B）；檢測波長296 nm；體積流量0.7 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，分別制成蟾毒它靈0.051 3 mg／mL、蟾毒靈0.053 8 mg／mL、華蟾酥毒基0.085 0 mg／mL、脂蟾毒配基0.050 0 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取干蟾皮藥材粉末（過3 號篩），精密稱定2.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加熱回流1 h，濾過，濃縮回收甲醇，用甲醇定容到5 mL，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 圖Fig.1 HPLC spectrogram of various constituents

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品，分別進樣測定，記錄峰面積，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度試驗 精密吸取4 種對照品溶液各20 μL，進樣測定6次，測得蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品峰面積RSD 分別為0.53%、0.74%、0.81%、0.92%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 0～12 h 內(nèi)每間隔2 h 分別進樣1次，測得蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積RSD 分別為1.64 %、1.47 %、0.68%、1.09 %，表明樣品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗 平行制備6 份樣品，進樣測定，測得蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積RSD 分別為1.59%、2.35%、1.54%、1.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗 樣品分成3 組（高、中、低質(zhì)量濃度），每組2份，每份1 g，精密加入4 種對照品貯備液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，吸取20 μL 進樣測定，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.8 含量測定 稱取一定量4 種不同年限的干蟾，精密稱定，分3 次進樣，測定藥材中各成分含量，見表4、圖2。

圖2 蟾毒配基類成分含量百分比Fig.2 Percentage contents of bufogenin constituents

表4 各成分含量測定結(jié)果（mg／g）Tab.4 Results of content determination for various constituents（mg／g）

3 討論

通過對干蟾的性狀進行分析總結(jié)，干蟾隨年份增長顏色加深、質(zhì)量增大、耳后腺及皮脂腺數(shù)目增多且逐漸充盈。HPLC 法測定華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈4 種指標(biāo)成分含量，10年生與3 年生相比，分別下降70.1%、63.5%、64.1%、75.1%。干蟾中4 種蟾毒配基類成分含量呈逐年下降趨勢，為3 年生＞5 年生＞8 年生＞10年生。

歷代本草所述蟾蜍越大，痱磊越多，藥效更強。這與本實驗結(jié)果相悖，是由于干蟾中的化學(xué)成分隨年份增長積累至痱磊中且古時蟾蜍用法多為活蟾剝?nèi)∑?，不刮去痱磊中分泌物，而本研究對象為刮漿后的干蟾，結(jié)合劉美等［12］研究發(fā)現(xiàn)，蟾酥中的化學(xué)成分含量高于干蟾中化學(xué)成分含量，因此呈現(xiàn)成分含量隨年限增長而逐年下降趨勢。歷代本草中記載蟾蜍皮主要用于治療惡瘡，其主要物質(zhì)基礎(chǔ)是蟾蜍毒素類成分［13］，而本研究測定的指標(biāo)成分為蟾毒配基類成分，其細胞毒性較小，主要為強心作用［14］。

市場上干蟾炮制加工方式主要有2種，一種是刮漿后去除內(nèi)臟、骨骼、肌肉纖維，另一種是刮漿后僅去除內(nèi)臟。歷代本草中記載［15?16］均以蟾蜍皮入藥，現(xiàn)今市場為提高藥材產(chǎn)量常見第二種炮制方式，依據(jù)本研究結(jié)果及羅毅［17］、周謐［11］等研究分析，保留骨骼、肌肉纖維會造成各成分比例變化，減緩干燥速率，導(dǎo)致微生物繁殖，造成干蟾菌檢不合格，影響干蟾的臨床療效。

3 年生干蟾中蟾毒配基類成分含量最高，但為使蟾蜍類藥材經(jīng)濟效益最大化，應(yīng)綜合考慮蟾蜍其他藥用資源（干蟾、蟾衣、蟾酥）的效益，蟾酥中的蟾毒配基類成分含量遠高于干蟾及蟾衣，且隨年份增長，干蟾質(zhì)量增大，因此干蟾應(yīng)在蟾蜍生長8～10 年取盡蟾酥后采收為宜。