穆阿寧 梁引庫(kù) 李云祥劉旭

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中723000； 2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 漢中723000）

陰道炎是一種常見(jiàn)的陰道黏膜、黏膜結(jié)締組織發(fā)炎的疾病，也是患病率較高的婦科疾病之一，易引起宮頸炎，嚴(yán)重時(shí)會(huì)感染盆腔、上生殖道、腹腔［1］。治療陰道炎的抗生素較多，如硝基咪唑類、氟喹諾酮類等治療細(xì)菌性陰道炎［2］，咪唑類、三唑類等治療念珠性陰道炎，甲硝唑、替硝唑、硝基咪唑類治療滴蟲(chóng)性陰道炎［3］，雖然見(jiàn)效快，時(shí)間短，但也存在一定局限性［4］，易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致病情反復(fù)發(fā)作，困擾患者正常生活［5］。

隨著社會(huì)發(fā)展，人們面臨病菌威脅的形勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)峻，加上其自身變異后會(huì)產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致現(xiàn)有抗生素逐漸失去原有效果［6］。研究表明，病菌耐藥性、抗藥性主要體現(xiàn)在對(duì)某一種或幾種抗菌藥物的耐藥作用，但是當(dāng)多種藥物聯(lián)合作用時(shí)則能有效抑制其生長(zhǎng)［7］，故多重抗菌藥物正成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，其中中藥復(fù)方制劑是主要方向。因此，本實(shí)驗(yàn)篩選治療陰道炎的中藥方劑，并進(jìn)行優(yōu)化，以期為開(kāi)發(fā)相關(guān)制劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 蒲公英、五倍子、苦參、黃連、夏枯草、黃芩均購(gòu)自陜西省漢中市陜西美致惠健康大藥房連鎖有限公司，經(jīng)陜西理工大學(xué)李新生教授鑒定為正品。

1.2 菌株 金黃色葡萄球菌（批號(hào)ATCC25925）、白色念珠菌（批號(hào)ATCC10231）、加德納桿菌（批號(hào)ATCC14018），由陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，置于－80 ℃低溫冰箱中冷凍保存，實(shí)驗(yàn)前復(fù)蘇傳代。

1.3 試劑與藥物 瓊脂粉、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉購(gòu)自天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；石油醚購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；二甲基亞砜購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；無(wú)菌輔酶I、HTM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自上海瑞楚生物科技有限公司；7 mm 無(wú)菌紙片為自制。

1.4 儀器 HC?250 型搖擺式粉碎機(jī)購(gòu)自永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；DHG?9203A 型真空干燥箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；2XZ 型旋片式真空泵購(gòu)自臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司；HH?S4 型電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自北京科偉永興儀器有限公司；FA2204B 型電子天平購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV2550 型分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司；DHP?9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW?CJ?1D 型單人超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索與分析 在CNKI 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“白色念珠菌”“加德納桿菌”“金黃色葡萄球菌”為研究對(duì)象，“中藥”“需氧細(xì)菌性陰道炎”“細(xì)菌性陰道炎”“霉菌性陰道炎”為關(guān)鍵詞，初步篩選具有抗菌作用的中藥，作為中藥方劑候選復(fù)方組分。結(jié)果，對(duì)陰道炎有抑制作用的中藥有123種，并且活性成分種類很多，包括生物堿、黃酮、苯丙素、揮發(fā)油等［8］，其中對(duì)白色念珠菌、加德納桿菌、金黃色葡萄球菌有效果者見(jiàn)表1［9?23］。

表1 對(duì)陰道炎相關(guān)致病菌有抑制作用的中藥

由此可知，黃芩對(duì)白色念珠菌的抑制效果優(yōu)于其他中藥；苦參、黃芩對(duì)加德納桿菌表現(xiàn)為高敏感性；夏枯草、五倍子、黃連抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)能力最強(qiáng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英所含酚類成分對(duì)白色念珠菌、加德納桿菌的抑制作用較強(qiáng)，其機(jī)制與破壞兩者生物膜有關(guān)［24］。因此，初步將蒲公英、黃芩、苦參、夏枯草、五倍子、黃連作為中藥方劑候選組分。

2.2 提取物制備 將“2.1”項(xiàng)下6 種中藥方劑候選組分在70 ℃下干燥至恒重，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60 目篩，稱取適量粉末，按照比例分別加入水、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚進(jìn)行提取，即得，置于60 ℃真空干燥箱中揮盡水分得到浸膏，在4 ℃下保存。

2.3 中藥方劑組分篩選 采用紙片抑菌法考察“2.2”項(xiàng)下提取物（質(zhì)量濃度均為100 mg／mL）對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、加德納桿菌的抑制作用，測(cè)定抑菌圈直徑，空白對(duì)照組紙片滴加相應(yīng)藥物溶劑［8］，結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表2 提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

由此可知，黃連醇提物對(duì)白色念珠菌的抑制能力最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌也有較強(qiáng)作用；五倍子水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、加德納桿菌的抑制能力較強(qiáng)；苦參乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、加德納桿菌的抑制能力最強(qiáng)；蒲公英乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、加德納桿菌的抑制能力較強(qiáng)；黃芩水提物、醇提物、乙酸乙酯提取物及夏枯草水提物、醇提物對(duì)3 種致病菌均有一定抑制能力，但均不突出。綜上所述，黃連醇提物、五倍子水提物、苦參乙酸乙酯提取物、蒲公英乙酸乙酯提取物具有良好的抑菌作用。

表4 提取物對(duì)加德納桿菌的抑制作用

2.4 最小抑菌濃度測(cè)定 將活化好的3 種致病菌調(diào)至最佳吸光度作為指示菌，其中金黃色葡萄球菌接種于LB 液體培養(yǎng)基，白色念珠菌接種于沙氏液體培養(yǎng)基，加德納桿菌接種于HTM 液體培養(yǎng)基，再配制256 mg／mL 提取物母液，接入5%調(diào)好濃度的菌懸液，37 ℃、200 r／min 培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組質(zhì)量濃度0 mg／mL，以藥物組試管內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）。另外，由于中藥顏色和提取物渾濁度的影響，故采用無(wú)菌接種環(huán)充分蘸取對(duì)應(yīng)管中液體，轉(zhuǎn)涂于相應(yīng)培養(yǎng)基時(shí)后，在37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)12 h，劃線處無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)確定為MIC。

采用倍比稀釋法［25］測(cè)定“2.3”項(xiàng)下4 種提取物對(duì)致病菌的MIC，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，黃連醇提物對(duì)白色念珠菌的抑制能力最強(qiáng)；苦參乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、加德納菌的抑制能力最強(qiáng)；蒲公英乙酸乙酯提取物對(duì)3 種致病菌均有一定抑制能力，但均不突出；五倍子水提物對(duì)白色念珠菌的抑制能力較弱。

表5 提取物對(duì)致病菌的MIC

2.5 正交試驗(yàn) 選擇“2.4”項(xiàng)下抑菌效果顯著（MIC 較低）的提取物，按照正交表L9（34）配成中藥方劑，以蒲公英乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度（A）、五倍子水提物質(zhì)量濃度（B）、苦參乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度（C）、黃連醇提物質(zhì)量濃度（D）為影響因素，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，加入0.25、0.5、0.75 倍MIC 蒲公英提取物后，加德納桿菌細(xì)胞膜遭到破壞，細(xì)胞通透性增強(qiáng)［8］，故每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，分別為1、0.5、0.25 倍MIC，并以抑菌圈直徑（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)［26］優(yōu)化配方。

2.5.1 加德納桿菌 因素水平見(jiàn)表6，結(jié)果見(jiàn)表7，可知各因素影響程度依次為C＞A＞B＞D。方差分析見(jiàn)表8，可知因素A、B、C有顯著影響（P＜0.01），而D無(wú)顯著影響（P＞0.05）。最終確定，最優(yōu)配方為A3B2C1D2，即8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 五倍子水提物、16 mg／mL苦參乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黃連醇提物（四者質(zhì)量濃度比例為1∶2∶2∶2）。

表6 對(duì)加德納桿菌抑制作用的因素水平

表7 對(duì)加德納桿菌抑制作用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表8 對(duì)加德納桿菌抑制作用的方差分析

2.5.2 金黃色葡萄球菌 因素水平見(jiàn)表9，結(jié)果見(jiàn)表10，可知各因素影響程度依次為D＞B＞C＞A。方差分析見(jiàn)表11，可知各因素均有顯著影響（P＜0.01）。最終確定，最優(yōu)配方為A1B1C1D3，即16 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、16 mg／mL五倍子水提物、2 mg／mL 苦參乙酸乙酯提取物、4 mg／mL 黃連醇提物（四者質(zhì)量濃度比例為8∶8∶1∶2）。

表9 對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的因素水平

表10 對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表11 對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的方差分析

2.5.3 白色念珠菌 因素水平見(jiàn)表12，結(jié)果見(jiàn)表13，可知各因素影響程度依次為C＞B＞D＞A。方差分析見(jiàn)表14，可知各因素均有顯著影響（P＜0.01）。最終確定，最優(yōu)配方為A3B2C1D1，即8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、32 mg／mL五倍子水提物、32 mg／mL 苦參乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黃連醇提物（四者質(zhì)量濃度比例為1∶4∶4∶2）。

表12 對(duì)白色念珠菌抑制作用的因素水平

表13 對(duì)白色念珠菌抑制作用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表14 對(duì)白色念珠菌抑制作用的方差分析

2.6 抑菌作用篩選 分別將“2.5.1”“2.5.2”“2.5.3”項(xiàng)下優(yōu)化配方命名為配方1、配方2、配方3，其抑制效果見(jiàn)圖1。再以抑菌圈直徑為指標(biāo)，將抑菌能力最弱的配方2分別與配方1、配方3 進(jìn)行組間方差分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 各配方對(duì)致病菌的抑制效果

圖2 各配方抑菌圈直徑

由此可知，指示菌為金黃色葡萄球菌時(shí)，與配方2 比較，配方1 抑菌圈直徑無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明兩者抑菌作用相當(dāng)；配方3 抑菌圈直徑增大（P＜0.01），達(dá)14.67 mm，表明其抑菌作用最強(qiáng)。指示菌為加德納桿菌時(shí)，與配方2 比較，配方1、配方3 抑菌圈直徑無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明三者抑菌作用相當(dāng)。指示菌為白色念珠菌時(shí)，與配方2 比較，配方1 抑菌圈直徑無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明兩者抑菌作用相當(dāng)；配方3 抑菌圈直徑增大（P＜0.05），表明其抑菌作用最強(qiáng)。綜上所述，配方3 為治療陰道炎的最佳中藥方劑。

3 討論與結(jié)論

陰道炎按疾病起因分類，需氧性細(xì)菌陰道炎、厭氧性細(xì)菌陰道炎、霉菌性陰道炎、滴蟲(chóng)性陰道炎占據(jù)總數(shù)的90%，其中需氧性細(xì)菌陰道炎主要由需氧性細(xì)菌引起，常見(jiàn)的有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈霉菌等；厭氧性細(xì)菌陰道炎在成年女性中最容易發(fā)生，主要由厭氧性細(xì)菌引起，乳酸桿菌菌群減少或缺失導(dǎo)致陰道pH 值上升，引起加德納菌屬大量繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致陰道黏膜發(fā)生炎癥；霉菌性陰道炎主要由假絲酵母菌引起，其中白色念珠菌是最主要的感染細(xì)菌，其感染陰道時(shí)可引起外陰、陰道瘙癢，近年來(lái)抗生素大量使用導(dǎo)致陰道內(nèi)環(huán)境酸堿度上調(diào)，為該病菌增殖提供了條件，進(jìn)而導(dǎo)致陰道疾病反復(fù)發(fā)作。因此，本實(shí)驗(yàn)選取金黃色葡萄球菌、加德納桿菌、白色念珠菌作為病原菌，篩選治療陰道炎的中藥方劑。

在前期蒲公英提取物研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研篩選出6 味中藥，分別為黃連、五倍子、黃芩、夏枯草、苦參、蒲公英，通過(guò)紙片抑菌法確定蒲公英乙酸乙酯提取物、五倍子水提物、苦參乙酸乙酯提取物、黃連醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、加德納桿菌、白色念珠菌具有良好的抑制效果，其中黃連醇提物抑制白色念珠菌的作用顯著優(yōu)于其他三者，蒲公英、苦參乙酸乙酯提取物及五倍子水提物對(duì)加德納菌的抑制能力顯著高于黃連醇提物。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化配方，得到配方1～3，對(duì)抑制上述3 種致病菌各有優(yōu)勢(shì)，其中配方3 效果最突出，其組成為8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、32 mg／mL 五倍子水提物、32 mg／mL苦參乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黃連醇提物（即四者質(zhì)量濃度比例為1∶4∶4∶2），它通過(guò)不同中藥之間的復(fù)配關(guān)系來(lái)增強(qiáng)藥效，以達(dá)到安全、低毒、經(jīng)濟(jì)的目的，可為開(kāi)發(fā)新型治療陰道炎的藥物提供思路。