朱 君 付立霞 支青劉雄利陳琳田民義王慧娟?

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／農(nóng)業(yè)生物工程研究院， 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心， 貴州 貴陽550025； 2.貴州大學(xué)西南藥食兩用資源開發(fā)利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心， 貴州 貴陽550025； 3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽550025）

炎癥是宿主系統(tǒng)受病原體、損傷細(xì)胞或其它異物等刺激時(shí)所產(chǎn)生的一系列保護(hù)性免疫應(yīng)答，是抵抗自然感染和恢復(fù)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的天然手段。炎癥是由各種炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)觸發(fā)的，這些炎癥因子從諸如巨噬細(xì)胞等促炎細(xì)胞中釋放出來［1?2］。在正常情況下，炎癥對于機(jī)體的生理功能是有益的，但過度和持續(xù)的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致機(jī)體受到損害，如降低其對組織損傷、感染或疫苗接種等信號的感知和反應(yīng)能力，導(dǎo)致先天免疫反應(yīng)失調(diào)［3?4］。臨床抗炎藥物主要分為甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥，具有較多不良反應(yīng)，長期大量使用會對胃腸道、肝臟、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等造成損害［5］，因此，從天然藥物中尋找新的抗炎藥物有重要的意義。

?？浦参锷５母稍锬壑θ胨帪樯Ｖ?，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［6］，具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)的功效。現(xiàn)代研究表明，桑枝化學(xué)成分種類多樣，包括黃酮、生物堿和香豆素等，具有抗炎、降血糖、抗氧化和抑菌等藥理活性［7?8］。目前，關(guān)于桑枝乙醇提取物的抗炎活性及作用機(jī)制少有報(bào)道。本研究采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的體外炎癥模型，并基于核轉(zhuǎn)錄因子?κB（nuclear factor?κB，NF?κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinases，MAPKs）信號通路探究桑枝乙醇提取物的抗炎作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院昆明動物研究所細(xì)胞庫。

1.2 試劑與藥物 桑枝飲片（產(chǎn)地安徽，批號200706），購自貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司。蘆丁對照品（批號100080?202012，含量92.2%），購自中國食品藥品檢定研究院；噻唑藍(lán)（MTT，批 號 715F0510）、LPS（批號818ED35）、地塞米松（批號320E051），購自北京索萊寶科技有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號8121551），購自美國Gibco 公司；胎牛血清（批號21090705），購自浙江天杭生物科技股份有限公司；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（批號120320210430）、BCA 總蛋白定量試劑盒（批號112720201223）、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（批號041521210820）、活性氧（ROS）檢測試劑盒（批號112420201215），購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL?6 ELISA 試劑盒（批號A20611035）、TNF?α ELISA 試劑盒（批號A28210852），購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；兔抗小鼠抗體 GAPDH（批號 2118S）、iNOS（批號13220S）、COX2（批號12282S）、P65（批號8242S）、p?IKBα（批號2859S）、IKBα（批號4812S）、p38（批號9212S）、p?p38（批號9211S）、JNK（批號9252S）、p?JNK（批號 9251S）、ERK（批號 4695T）、p?ERK（批號4370T），購自美國Cell Signaling Technology 公司；兔抗小鼠PARP（批號AB32138），購自英國Abcam 公司；山羊抗兔二抗（批號ABS20002），購自愛必信（上海）生物科技有限公司；Total RNA Kit（批號R6834010002），購自美國BioTek 公司；RT Easy（批號210401）和Real Time PCR Easy SYBR GREEN（批號P210501），購自成都福際生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 RE?2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；W?5200 型紫外可見分光光度計(jì)，購自上海元析儀器有限公司；Varioskan LUX 型多功能酶標(biāo)儀、3111 型CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購自美國Thermo Fisher Scientifie 公司；DMi8 型倒置熒光相差顯微鏡，購自德國徠卡公司；XPE205 型十萬分之一電子天平，購自瑞士Mettler Toledo公司；ChemiDocTMTouch Imaging System 型V3 蛋白免疫印跡系統(tǒng)、CFX ConnectTMReal?Time System 型三通道梯度熒光定量PCR 分析儀，購自美國Bio?Rad 公司。

2 方法

2.1 桑枝乙醇提取物的制備 取適量桑枝飲片粉碎，加10 倍量70%乙醇回流提取，提取2次，每次1.5 h，合并提取液，抽濾，減壓濃縮，冷凍干燥后得到干燥粉末，提取率為6.60%。

2.2 桑枝乙醇提取物中總黃酮含量檢測

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定蘆丁對照品15.32 mg，置50 mL 量瓶中，加適量70%乙醇超聲處理使之溶解，放冷，70%乙醇定容至刻度，搖勻備用。精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置于25 mL 量瓶中，各加蒸餾水至6 mL，加5% 亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，采用紫外可見分光光度計(jì)于500 nm 波長處檢測吸光度值。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

2.2.2 樣品檢測 稱取桑枝乙醇提取物125 mg，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，70% 乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL 量瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，自“加蒸餾水至6 mL”起，依法檢測吸光度，同時(shí)精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為空白溶液。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中蘆丁的含量，并計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞采用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基（加100 μg／mL 雙抗和2 mmol／L 谷氨酰胺），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4 MTT 法檢測細(xì)胞活性 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板，密度為6.25×104／mL，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，分別設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種24 h 后加入不同質(zhì)量濃度桑枝乙醇提取物（3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1 000 μg／mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入10 μL 5 mg／mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩后于490 nm波長處檢測吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5 細(xì)胞上清液NO、IL?6、TNF?α 水平檢測 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板，密度為6.25×104／mL，隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性組和桑枝乙醇提取物組，分別設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種24 h后，對照組換用DMEM 高糖培養(yǎng)基；模型組換用含LPS（1 μg／mL）的DMEM 高糖培養(yǎng)基；陽性組換用含LPS（1 μg／mL）＋地塞米松（20 μg／mL）的DMEM 高糖培養(yǎng)基；桑枝乙醇提取物組換用含LPS（1 μg／mL）＋桑枝乙醇提取物（40、80、160 μg／mL）的DMEM 高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取各組上清培養(yǎng)基，按照NO 檢測試劑盒說明書采用Griess 法檢測各組細(xì)胞上清液NO 水平，按照相應(yīng)ELISA 試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞上清液IL?6、TNF?α水平。

2.6 DCFH?DA 熒光探針法檢測細(xì)胞中ROS 水平 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞接種于6 孔板，密度為6.25×104／mL，按照“2.5”項(xiàng)下方法分組培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，PBS 潤洗2次，每孔加1 mL 稀釋液（用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基按1∶1 000 比例稀釋DCFA?DA），于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下設(shè)置激發(fā)波長460～500 nm，發(fā)射波長512～542 nm 進(jìn)行熒光拍攝。拍攝完成后，加胰酶消化，每孔加入900 μL PBS 制成細(xì)胞懸液，取200 μL 加入96 孔板（每組3 個(gè)復(fù)孔），避光靜置30 min，在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm 條件下檢測熒光強(qiáng)度。

2.7 RT?qPCR 法檢測細(xì)胞相關(guān)炎癥因子mRNA 表達(dá) 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞接種于6 孔板，密度為6.25×104／mL，按照“2.5”項(xiàng)下方法分組培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，按照Total RNA Kit 試劑盒說明書提取總RNA。反應(yīng)體系按照Real Time PCR Easy SYBR GREEN 試劑盒說明書配制，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共循環(huán)40 次。以β?actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法計(jì)算相關(guān)基因mRNA 表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.8 Western blot 法檢測炎癥相關(guān)通路蛋白表達(dá) 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞接種于6 孔板，密度為6.25×104／mL，按照“2.5”項(xiàng)下方法分組培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，采用RIPA 裂解液（含1% 蛋白酶抑制劑）提取總蛋白，再按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒進(jìn)行胞漿蛋白和核蛋白的提取，采用BCA 總蛋白定量試劑盒檢測各樣品中蛋白濃度。蛋白先進(jìn)行SDS?PAGE 凝膠電泳，再將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶封閉1 h，TBST洗膜，加一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗膜，加二抗（羊抗兔）孵育1 h，ECL 法顯色，并于顯影儀上顯影曝光。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桑枝乙醇提取物中總黃酮的含量 如圖1 所示，蘆丁對照品溶液在11.30～67.80 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A＝0.009 58X－0.023 3（R2＝0.999）。參照蘆丁對照品吸光度值計(jì)算得桑枝乙醇提取物中總黃酮含量為（8.47±0.12）%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 桑枝乙醇提取物對RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響 如圖2 所示，與對照組比較，桑枝乙醇提取物在3.9～250 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對RAW264.7 細(xì)胞存活率無明顯影響（P＞0.05），500、1 000 μg／mL 桑枝乙醇提取物組細(xì)胞存活率降低（P＜0.01）。因此，本研究選擇40、80、160 μg／mL 質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 桑枝乙醇提取物對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響（，n＝3）

3.3 桑枝乙醇提取物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞上清液NO、TNF?α、IL?6 水平的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中NO、TNF?α、IL?6 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，桑枝乙醇提取物組可以抑制RAW264.7 細(xì)胞NO、TNF?α、IL?6 的釋放（P＜0.05，P＜0.01）。提示，桑枝乙醇提取物對LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子水平升高具有抑制作用，表現(xiàn)出較好的劑量依賴性。

圖3 桑枝乙醇提取物對RAW264.7 細(xì)胞上清液NO、TNF?α、IL?6 水平的影響（，n＝3）

3.4 桑枝乙醇提取物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞ROS 水平的影響 炎癥反應(yīng)的發(fā)生伴隨著氧化應(yīng)激，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激會產(chǎn)生大量的ROS 并抑制氧自由基清除劑SOD 等酶的活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷［9］。如圖4 所示，與對照組比較，模型組RAW264.7 細(xì)胞在LPS 的刺激下，ROS 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，桑枝乙醇提取物干預(yù)后，細(xì)胞ROS 水平降低（P＜0.01），表明桑枝乙醇提取物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞ROS 水平上調(diào)具有抑制作用。

圖4 桑枝乙醇提取物對RAW264.7 細(xì)胞ROS 水平的影響（，n＝3）

3.5 桑枝乙醇提取物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子及M1／M2 型標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的影響 如圖5 所示，對照組RAW264.7 細(xì)胞呈圓形；模型組細(xì)胞主要為梭形；而桑枝乙醇提取物組細(xì)胞隨著干預(yù)劑量的增加，梭形和不規(guī)則細(xì)胞逐漸減少，圓形細(xì)胞增多。如圖6 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞COX?2、iNOS、TNF?α、IL?6 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），Arg?1、IL?10 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，桑枝乙醇提取物組細(xì)胞COX?2、iNOS、TNF?α、IL?6、IL?1βmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），Arg?1、IL?10 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。提示，桑枝乙醇提取物可以降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子mRNA 表達(dá)，并且可以調(diào)控LPS 引起的RAW264.7 細(xì)胞由M1 型（標(biāo)志物iNOS、TNF?α、IL?6、IL?1β）向M2 型（標(biāo)志物Arg?1、IL?10）的轉(zhuǎn)化。

圖5 各組RAW264.7 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

圖6 桑枝乙醇提取物對RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子及M1／M2 型標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的影響（，n＝3）

3.6 桑枝乙醇提取物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞iNOS、COX?2 蛋白及NF?κB、MAPKs 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖7 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞iNOS、COX?2 蛋白、細(xì)胞核P65／胞漿P65 蛋白比值及IKBα、p38、JNK、ERK 蛋白磷酸化表達(dá)均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，桑枝乙醇提取物干預(yù)后，細(xì)胞iNOS、COX?2 蛋白、細(xì)胞核P65／胞漿P65 蛋白比值及IKBα、p38、JNK、ERK 蛋白磷酸化表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示，桑枝乙醇提取物可能通過調(diào)節(jié)NF?κB 和MAPKs 這2 條信號通路的蛋白表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用。

圖7 桑枝乙醇提取物對RAW264.7 細(xì)胞iNOS、COX?2 蛋白及NF?κB、MAPKs 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）

4 討論

脂多糖是在革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌內(nèi)毒素，已被廣泛用于體內(nèi)和體外引起各種免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答，包括巨噬細(xì)胞的活化［10］。RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的一種，常用作體外炎癥模型［11］。受LPS 激活的RAW264.7 細(xì)胞會產(chǎn)生大量的炎性因子，引起炎癥反應(yīng)和組織損傷。其中，iNOS 作為一種前促炎因子，在體內(nèi)可以催化L?Arg 產(chǎn)生NO，而NO 在高水平狀態(tài)下，可以誘導(dǎo)TNF?α、IL?6 和IL?1β 等促炎因子的產(chǎn)生［12?13］。COX?2 是合成體內(nèi)前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的一種限速酶，主要由MAPKs 信號通路中的ERK 入核調(diào)控表達(dá)，而PGE2在炎癥反應(yīng)中可以促進(jìn)炎癥的發(fā)生和作為誘導(dǎo)疼痛的炎性介質(zhì)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，桑枝乙醇提取物可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子NO、TNF?α 和IL?6 水平，還能降低LPS 誘導(dǎo)的ROS 水平，提示桑枝乙醇提取物對LPS 誘導(dǎo)的炎癥具有抑制作用。

巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化在病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，M1 型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促炎、吞噬病原體的作用，M2 型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促進(jìn)組織重塑、損傷修復(fù)等作用［15?16］。本研究發(fā)現(xiàn)，桑枝乙醇提取物可以減少LPS 誘導(dǎo)的梭形和不規(guī)則RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)，下調(diào)由LPS 誘導(dǎo)的M1 型標(biāo)志物，同時(shí)促進(jìn)M2 型標(biāo)志物的表達(dá)。上述結(jié)果提示，桑枝乙醇提取物能抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1 型分化表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型分化。

CD14 是一種在髓樣細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的相對分子量為53 kDa的糖蛋白［17］。作為LPS 受體，它具有識別LPS 并能與之結(jié)合，介導(dǎo)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞信息反應(yīng)。CD14 可以向受體復(fù)合物MD?2／TLR4 發(fā)出信號以呈遞LPS，并進(jìn)一步激活NF?κB 和MAPKs 信號通路［18?19］。NF?κB 通常以P65?P50 這種異二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF?κB 在細(xì)胞質(zhì)與抑制物IKBα 結(jié)合，處于非活化狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞受到外界信號刺激，IKBα 被磷酸化降解，并將P65 轉(zhuǎn)位入核與DNA 結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子IL?6、TNF?α 等大量表達(dá)［20?21］。本研究發(fā)現(xiàn)，桑枝乙醇提取物可減少P65 蛋白抑制物IKBα 磷酸化，同時(shí)降低轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核P65 蛋白表達(dá)。MAPKs 是真核細(xì)胞內(nèi)一類家族蛋白的統(tǒng)稱，其信號通路的活化，與ERK、JNK 和p38 的級聯(lián)激活有關(guān)，被活化的MAPK 信號通路從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核，促進(jìn)了炎癥因子的表達(dá)，并觸發(fā)多種生理反應(yīng)［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，桑枝乙醇提取物可以下調(diào)p38、JNK 和ERK 蛋白的磷酸化。

綜上所述，桑枝乙醇提取物能夠較好地抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其分子機(jī)制可能與抑制NF?κB 和MAPKs 信號通路有關(guān)。