薛 飛， 程炳鐸， 劉喜綱， 常金花， 劉 沛， 薛禾菲， 王汝興

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

在藥物合成或研發(fā)過程中，其本身有將近50%是水難溶性，溶解性差、生物利用度低、吸收不穩(wěn)定正成為主要問題[1-2]。納米晶體由于其靶向遞送作用和低毒性，在疾病診療中發(fā)揮著重要作用[3]，并且具有納米尺寸和更好的溶解性，可改變藥物藥動學(xué)和生物分布[4-5]。

粉防己堿為異喹啉類生物堿，是傳統(tǒng)中藥防己的主要成分，具有抗炎、抗腫瘤、降壓等藥理作用[6-7]，目前在臨床用藥中以中藥復(fù)方制劑為主[8]，但該成分胃腸道吸收較差，導(dǎo)致口服生物利用度低。因此，本實(shí)驗(yàn)將粉防己堿制成納米晶體，并評價其質(zhì)量，以期為相關(guān)應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 恒溫水浴鍋(金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠)；GT16-3高速離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)有限公司)；ZEN3690激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；QM3SP2行星式球磨機(jī)(南京馳順科技發(fā)展有限公司)；LGJ-22D冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)；Nexus傅立葉紅外光譜儀(美國熱電尼高力公司)；DMax-2400 X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；EQUINOX55傅里葉變換紅外光譜儀(德國布魯克光譜儀器公司)；掃描電子顯微鏡(日本尼康儀器公司)。

1.2 試劑與藥物 粉防己堿對照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度99.85%)；粉防己堿原料藥(西安山川生物技術(shù)有限公司)。羥丙基甲基纖維素(HPMC-E5, 北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司)；乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(PVP-VA64, 德國BASF公司)；吐溫-80(Tween-80, 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；泊洛沙姆407(P407, 北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮-K30(PVP-K30, 山東優(yōu)索化工科技有限公司)；聚乙二醇-4000(PEG-4000, 北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司)；聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus, 德國BASF公司)。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 粉防己堿含量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ODS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流動相乙腈-0.01 mmol/L磷酸二氫鉀(含0.1%三乙胺)(80∶20)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取粉防己堿對照品2.00 mg，置于10 mL量瓶中，少量甲醇超聲溶解后定容，得200.00 μg/mL貯備液，甲醇依次稀釋至3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL，作為對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=6.879X+0.971(R2=0.999 9)，在3.13～100.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取1 mL納米晶體溶液至10 mL量瓶中，去離子水稀釋至刻度，即得。

2.1.4 專屬性考察 取對照品溶液、供試品溶液、空白輔料適量，甲醇稀釋，搖勻，超聲處理，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，三者之間無相互干擾，表明該方法專屬性良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取4.0、50.0、80.0 μg/mL對照品溶液，同一天在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，考察日內(nèi)精密度；同法連續(xù)測定3 d，每天1次，考察日間精密度，測得日內(nèi)精密度RSD分別為0.29%, 0.15%、0.16%，日間精密度RSD分別為0.37%、0.48%、0.51%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取0.3、2.0、4.0 mL 200.0 μg/mL對照品溶液各3份，置于10 mL量瓶中，加入1.0 mL空白載體溶液，流動相定容，分別得到6.00、40.00、80.00 μg/mL溶液各3份，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，粉防己堿平均加樣回收率分別為101.62%、100.68%、99.37%，RSD分別為0.34%、1.68%、0.98%。

2.2 納米晶體制備 采用濕法研磨法[9]。在50 mL燒杯中加入適量去離子水，加入不同種類穩(wěn)定劑適量，攪拌分散至溶解，再加入不同比例原料藥，磁力攪拌至均勻分散，得粗混懸液，加到研磨罐中，與不同規(guī)格研磨珠混合后置于球磨機(jī)中，制得納米混懸液，精密吸取1 mL至西林瓶中，加入不同種類凍干保護(hù)劑適量，置于-80 ℃低溫冰箱中預(yù)凍4 h后進(jìn)行冷凍干燥，即得。

2.3 制備工藝優(yōu)化 采用單因素試驗(yàn)。

2.3.1 穩(wěn)定劑種類 按“2.2”項(xiàng)下方法制備納米混懸液30 mL，共8份，考察HPMC-E5、PVP-VA64、Tween-80、P407、PVP-K30、PEG-4000、Soluplus對其粒徑、PDI(將100 μL納米混懸液用去離子水稀釋400倍，采用激光粒度儀測定)的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，穩(wěn)定劑為P407時，納米混懸液粒徑最小，PDI在0.2～0.3范圍內(nèi)；為Tween-80時，納米混懸液粒徑與為P407時相差不大，但PDI在0.6～0.8范圍內(nèi)，表明其分布不均勻；其他穩(wěn)定劑所得納米混懸液的粒徑、PDI并不能達(dá)到理想效果。最終，選擇P407作為穩(wěn)定劑。

2.3.2 粉防己堿與穩(wěn)定劑比例 按“2.2”項(xiàng)下方法制備納米混懸液，考察粉防己堿與P407比例1∶1、3∶1、7∶1、10∶1對其粒徑、PDI的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，兩者比例為1∶1時，納米混懸液粒徑最小，PDI在0.2～0.3范圍內(nèi)。最終，選擇1∶1作為粉防己堿與穩(wěn)定劑比例。

2.3.3 研磨時間 按“2.2”項(xiàng)下方法制備納米混懸液，考察研磨時間10、40、60、80、100、120 min對其粒徑、PDI的影響，結(jié)果見圖4。由此可知，隨著研磨時間延長，納米混懸液粒徑、PDI逐漸下降，在120 min時兩者達(dá)到最小值。最終，選擇120 min作為研磨時間。

2.3.4 粉防己堿與研磨珠比例 按“2.2”項(xiàng)下方法制備納米混懸液，考察粉防己堿與氧化鋯珠比例1∶1、2∶3、1∶2對其粒徑、PDI的影響，結(jié)果見圖5。由此可知，兩者比例為1∶2時，納米混懸液粒徑最小，PDI最理想。最終，選擇1∶2作為粉防己堿與研磨珠比例。

2.3.5 研磨珠規(guī)格 按“2.2”項(xiàng)下方法制備納米混懸液，考察研磨珠規(guī)格0.2～0.3、0.4～0.8、0.8～1.0 mm對其粒徑、PDI的影響，結(jié)果見圖6。由此可知，規(guī)格為0.2～0.3 mm時，納米混懸液粒徑最小，PDI最理想。最終，選擇0.2～0.3 mm作為研磨珠規(guī)格。

2.4 凍干保護(hù)劑篩選

2.4.1 種類 按“2.3”項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備納米混懸液若干份，每份1 mL，分別加入葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖，用量均為2.5%，振蕩混勻，轉(zhuǎn)移到瓶中冷凍干燥，1 mL去離子水復(fù)溶，測定其粒徑、PDI，結(jié)果見圖7。由此可知，甘露醇為凍干保護(hù)劑時，納米混懸液粒徑最小，PDI最理想。最終，選擇甘露醇作為凍干保護(hù)劑。

2.4.2 用量 按“2.3”項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備納米混懸液，考察0、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%甘露醇對其粒徑、PDI的影響，結(jié)果見圖8。由此可知，用量為2.5%時，納米混懸液粒徑最小，PDI最理想。最終，選擇2.5%作為凍干保護(hù)劑用量。

2.5 溶出度測定 采用槳法，并設(shè)定轉(zhuǎn)速為100 r/min，每批樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。精密稱取原料藥14.00 mg、納米晶體100.00 mg、物理混合物(原料藥+P407+甘露醇)28.82 mg，加到900 mL 37 ℃純水(含0.2%SDS)中，于5、10、20、30、45、60 min各取樣5 mL，立即補(bǔ)充37 ℃純水，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算累積溶出度，繪制溶出曲線，結(jié)果見圖9。

由此可知，納米晶體溶出度從10 min開始均接近100%，即幾乎全部溶出；物理混合物累積溶出度低于納米晶體，但高于原料藥；60 min內(nèi)三者累積溶出度分別為94.32%，76.21%、52.09%，表明將粉防己堿制成納米晶體后可顯著改善其溶出度。

2.6 質(zhì)量評價

2.6.1 平均粒徑、Zeta電位測定 取納米晶體適量，1 mL去離子水復(fù)溶，精密量取20 μL，去離子水稀釋200倍，激光粒度儀測定平均粒徑，結(jié)果見圖10。由此可知，納米晶體粒徑為(128.22±6.25)nm，PDI為0.13±0.02，Zeta電位為(7.57±0.42)mV。

2.6.2 掃描電鏡 取原料藥、復(fù)溶后納米晶體適量，在掃描電鏡下觀察兩者形態(tài)，結(jié)果見圖11。由此可知，前者形態(tài)為塊狀，后者形態(tài)為棒狀。

2.6.3 X射線衍射

分別取空白輔料(P407、甘露醇)、原料藥、物理混合物、納米晶體約10 mg，進(jìn)行X射線衍射分析，設(shè)定條件為Cu靶/石墨單色器；掃描范圍3°～40°；電流30 mA；電壓40 kV，結(jié)果見圖12。

由此可知，原料藥呈現(xiàn)多個尖峰，表明以晶體形式存在；空白輔料具有結(jié)晶度低于原料藥的尖峰；在物理混合物對應(yīng)位置也存在與原料藥相同、強(qiáng)度較高的衍射峰；納米晶體中粉防己堿在11.69°、17.30°處的衍射峰消失，并且其他特征衍射峰強(qiáng)度有不同程度的減弱，表明有一部分轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形狀態(tài)。

3 討論

根據(jù)Ostwald Freundlich理論，小顆粒比大顆粒具有更高的飽和溶解度，由兩者之間濃度梯度導(dǎo)致溶解的藥物分子從小顆粒擴(kuò)散后，聚集在大顆粒表面，并導(dǎo)致顆粒增大[10-11]，故需加入穩(wěn)定劑以使藥物粒子大小盡量均一[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定劑選擇P407，其粒徑、PDI均優(yōu)于其他穩(wěn)定劑，當(dāng)粉防己堿與其比例為1∶1時，上述2種參數(shù)最理想。

介質(zhì)研磨法是最常用的制備納米晶體方法，但在研磨過程中會產(chǎn)生磨損，從而對納米藥物形成產(chǎn)生一定影響[14-15]，同時若研磨時間過短，無法使藥物均勻分散，而過長又會導(dǎo)致納米粒子聚集，藥物穩(wěn)定性降低，最終使其粒徑變大[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，延長研磨時間有利于納米晶體粒徑減小，但在100 min后變化不明顯，故確定研磨時間為120 min。

采用冷凍干燥法固化粉防己堿納米晶體時，可增加其穩(wěn)定性，但在操作過程中易引起粒子聚集，故需加入適宜凍干保護(hù)劑以減少上述現(xiàn)象發(fā)生[17]。研究表明，小分子量糖與糖醇的相互作用或空間效應(yīng)較強(qiáng)，其抗聚焦能力優(yōu)于高分子糖[18-19]，故本實(shí)驗(yàn)選擇2.5%甘露醇作為凍干保護(hù)劑。

本實(shí)驗(yàn)所制備的粉防己堿納米晶體為質(zhì)地疏松、色澤均勻的白色粉末，復(fù)溶后易分散，X射線衍射分析顯示，部分晶型發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化為無定形狀態(tài)，其原因可能是采用介質(zhì)研磨法制備時晶體中分子排列的緊密程度有所下降，干擾了藥物結(jié)晶狀態(tài)[20]，而峰強(qiáng)度降低可能是由于顆粒大小減少、結(jié)晶度改變所致[21]。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)藥物結(jié)晶度越低，溶出速率越快，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。