姚世霞， 劉東升， 牛鈺婷， 朱旭江， 劉志浩， 朱 琳

(甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

荊防顆粒由荊芥、防風(fēng)、柴胡、川芎、羌活、獨(dú)活、前胡等11味藥材組成，具有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕的功效[1]，來(lái)源于《攝生眾妙方》中的荊防敗毒散[2]，方中荊芥、防風(fēng)，散風(fēng)解表，為君藥；羌活、獨(dú)活散風(fēng)去濕，柴胡升清透表，川芎行血祛風(fēng)，共為臣藥；桔梗、枳殼、前胡、茯苓分別有開(kāi)肺、降氣、祛痰、滲濕之效，共為佐藥；甘草和中調(diào)藥，兼助益氣，為使藥[3-5]。新冠肺炎疫情發(fā)生以來(lái)，荊防敗毒散及其同方制劑荊防顆粒多地列入推薦群體性預(yù)防和治療的藥物[6-9]，該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)》，但僅有性狀與常規(guī)檢查項(xiàng)，不能滿(mǎn)足其質(zhì)量控制要求。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定荊防顆粒中升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素含量，并采用聚類(lèi)分析、主成分分析對(duì)7家廠家88批樣品進(jìn)行考察，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；ME204(萬(wàn)分之一)、MS205DU(十萬(wàn)分之一)電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 升麻素苷(批號(hào)111522-201712，純度96.2%)、橙皮苷(批號(hào)110721-201617，純度96.1%)、紫花前胡苷(批號(hào)110821-201604，純度99.6%)、柚皮苷(10722-201815，純度91.7%)、新橙皮苷(批號(hào)111857-201804，純度99.4%)、蛇床子素(批號(hào)110822-201710，純度99.5%)、白花前胡甲素(批號(hào)111711-201904，純度99.4%)對(duì)照品(中國(guó)藥品食品檢定研究院)；蕓香柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)P29M6R4，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；亥茅酚苷對(duì)照品(批號(hào)DST200306，純度≥98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司)。荊防顆粒共88批，來(lái)自2020年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽樣，涉及7家廠家。乙腈為色譜純(德國(guó)默克公司)；其他試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～4 min，10%A；4～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～45 min，20%～40%A；45～58 min，40%～80%A；58～73 min，80%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm(升麻素苷、亥茅酚苷)、280 nm(蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)、320 nm(紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素)。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品升麻素苷21.44 mg、亥茅酚苷14.26 mg、蕓香柚皮苷9.14 mg、柚皮苷23.72 mg、新橙皮苷17.06 mg、橙皮苷19.25 mg、紫花前胡苷14.99 mg、蛇床子素19.34 mg、白花前胡甲素14.11 mg，甲醇溶解，即得(質(zhì)量濃度分別為8.25、11.41、35.83、87.00、37.02、67.83、7.70、59.72、11.22 μg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，精密稱(chēng)取10 g，置于帶塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，80 ℃水浴回流提取2 h，晾至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例和工藝分別制備不含防風(fēng)、前胡、羌活、獨(dú)活、枳實(shí)的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)及專(zhuān)屬性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～3。由此可知，供試品溶液中顯示出與對(duì)照品溶液中對(duì)應(yīng)成分保留時(shí)間相同的色譜峰，分離度良好，陰性無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取1、2、5、10、15、20、30 μL對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，再以信噪比(S/N)3∶1為檢出限，10∶1為定量限，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.7 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素峰面積RSD分別為1.4%、1.3%、0.6%、0.8%、1.3%、0.5%、0.7%、1.8%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素峰面積RSD分別為0.8%、1.3%、0.6%、1.4%、0.9%、1.2%、1.3%、0.9%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(廠家C，批號(hào)0011901012)適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素含量RSD分別為3.1%、3.3%、1.5%、1.7%、1.9%、1.5%、2.8%、3.2%、3.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取本品(廠家C，批號(hào)0011901012)適量，置于錐形瓶中，分別按50%、100%、150%水平精密加入對(duì)照品溶液各3份，共9份，氮?dú)獯蹈扇軇芗尤氡酒? g，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素平均加樣回收率分別為92.9%、91.5%、92.4%、94.5%、94.0%、96.5%、92.1%、93.4%、92.9%，RSD分別為1.9%、1.7%、2.1%、1.8%、1.4%、1.1%、3.0%、2.8%、2.3%。

2.11 樣品含量測(cè)定 取不同廠家、批次樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果

2.12 化學(xué)計(jì)量學(xué)研究

2.12.1 聚類(lèi)分析 采用SPSS 23.0軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，以平均歐式距離為標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)換值標(biāo)準(zhǔn)化選擇Z得分，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，各廠家聚為3類(lèi)，B、D、E為1類(lèi)，A、C聚為1類(lèi)，F(xiàn)、G為1類(lèi)。

2.12.2 主成分分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)前2個(gè)主成分特征值均大于1，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)89.11%，故以其代替9個(gè)變量，結(jié)果見(jiàn)表3、圖5。由此可知，亥茅酚苷、白花前胡甲素、紫花前胡苷、蛇床子素、升麻素苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷含量在第一主成分中的載荷值較高，蛇床子素、升麻素苷、蕓香柚皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、橙皮苷含量在第二主成分中的載荷值較高，以各成分因子得分乘以對(duì)應(yīng)特征值的算術(shù)平方根為主成分得分F1、F2，以其方差貢獻(xiàn)率占累積方差貢獻(xiàn)率的比例為權(quán)重，計(jì)算綜合得分F，公式為F=(49.924F1+39.184F2)/89.108。結(jié)果，不同廠家樣品綜合得分依次為F>G>C>A>D、B、E(后三者得分接近)，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

表3 總方差解釋

2.12.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA) 將表2結(jié)果導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立PLS-DA模型[10]，結(jié)果見(jiàn)圖6，可知數(shù)據(jù)矩陣的結(jié)實(shí)率參數(shù)R2X為0.99，模型區(qū)分參數(shù)R2Y為0.79，模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2為0.76，均大于0.50，表明模型穩(wěn)定性、預(yù)測(cè)性均較好。再提取9個(gè)變量的重要性投影值(VIP)，見(jiàn)圖7，以VIP>1為標(biāo)準(zhǔn)，得到質(zhì)量差異標(biāo)志物為柚皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蕓香柚皮苷。

3 討論

3.1 樣品提取方法選擇 在2020年版《中國(guó)藥典》一部中，防風(fēng)、前胡、羌活、獨(dú)活、枳實(shí)均以甲醇為提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)超聲、回流提取進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)回流后各成分純度高于超聲后，并且在2 h時(shí)保持穩(wěn)定。最終確定，樣品提取方法為50 mL甲醇回流2 h。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各成分紫外最大吸收波長(zhǎng)分別為升麻素苷250、296 nm，亥茅酚苷299 nm，蕓香柚皮苷282 nm，柚皮苷282 nm，橙皮苷282 nm，新橙皮苷283 nm，紫花前胡苷334 nm，蛇床子素320 nm，白花前胡甲素321 nm。綜合考慮，確定檢測(cè)波長(zhǎng)分別為升麻素苷、亥茅酚苷254 nm，柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷280 nm，紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素320 nm。

3.3 指標(biāo)成分確定 荊防顆粒中枳殼含有蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷[11]，防風(fēng)含有升麻素苷、亥茅酚苷[12]，前胡、羌活含有紫花前胡苷、白花前胡甲素[13-14]，獨(dú)活含有蛇床子素[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇上述成分作為指標(biāo)。

4 結(jié)論

隨著荊防顆粒在治療新冠肺炎中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[16-18]，加強(qiáng)該制劑質(zhì)量控制刻不容緩。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定荊防顆粒中升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素的含量，該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，重復(fù)性、準(zhǔn)確性良好，穩(wěn)定可靠，可為相關(guān)生產(chǎn)廠家加強(qiáng)質(zhì)量控制和優(yōu)化生產(chǎn)工藝提供參考。