廖禹程， 丁 一， 張娟利， 王婧雯， 文愛東， 李銳莉， 胡君萍， 楊建華

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

祛風(fēng)止痛膠囊收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部，方中老鸛草為君藥，用量最大，具有清熱利濕、祛風(fēng)通絡(luò)等功效[1]；槲寄生、續(xù)斷為臣藥，具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎、止崩漏、祛風(fēng)濕等功效[2-3]；威靈仙、獨(dú)活、制草烏、紅花為佐使藥，具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、散濕去腫、通絡(luò)止痛等功效[4-5]，該制劑在祛風(fēng)寒、補(bǔ)肝腎、壯筋骨方面療效確切，可用于治療風(fēng)寒濕邪閉阻、肝腎虧虛所致的痹病，同時(shí)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、偏頭痛也能起到良好效果[6-8]。

近年來，通過指紋圖譜來全面反映中藥制劑中化學(xué)成分的質(zhì)量控制方法已成為國(guó)內(nèi)外流行的評(píng)價(jià)模型[9-12]，但尚無祛風(fēng)止痛膠囊的相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)首次建立了祛風(fēng)止痛膠囊HPLC指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定沒食子酸、馬錢苷酸、紫丁香苷、柯里拉京、馬錢苷、鞣花酸、蛇床子素的含量，該方法實(shí)用高效，可為該制劑質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，從而保證臨床用藥的安全性和有效性。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津公司)；YP10002型電子分析天平(十萬分之一，上海衡際科學(xué)儀器有限公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q System超純水儀(美國(guó)密理博公司)。

1.2 試劑與藥物 祛風(fēng)止痛膠囊共10批(陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)分別為20190322、20190423、20190508、20190606、20190712、20190820、20190915、20191007、20191108、20191202)。沒食子酸(批號(hào)110831-201906，純度91.5%)、馬錢苷酸(批號(hào)111865-202005，純度97.5%)、紫丁香苷(批號(hào)111574-201605，純度95.2%)、柯里拉京(批號(hào)111623-200302，純度98%)、馬錢苷(批號(hào)111640-201808，純度99%)、鞣花酸(批號(hào)111959-201903，純度88.8%)、蛇床子素(批號(hào)110822-201710，純度99.5%)對(duì)照品均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；磷酸為優(yōu)級(jí)純(天津永晟精細(xì)化工有限公司)。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min, 5%A; 10～20 min, 5%～20%A; 20～40 min, 20%～25%A; 40～50 min, 25%～40%A; 50～70 min, 40%～50%A; 70～80 min, 50%～70%A; 80～90 min, 70%～90%A; 90～100 min, 90%～100%A)；體積流量1.0 mL/min; 柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm; 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、馬錢苷酸、紫丁香苷、柯里拉京、馬錢苷、鞣花酸、蛇床子素對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為58、122、24、58、25、26、27 μg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品5粒，混合均勻，研成細(xì)粉，精密稱取0.2 g，置于量瓶中，甲醇定容至10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，冷卻，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，充分搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)估系統(tǒng)(2012A版)”[13]，中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算相似度，結(jié)果見表1，可知均大于0.986，表明本品內(nèi)在質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

表1 10批樣品相似度

2.5 色譜峰鑒定 10批樣品HPLC指紋圖譜中有21個(gè)共有峰，見圖1，通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出4號(hào)峰為沒食子酸，6號(hào)峰為馬錢苷酸，7號(hào)峰為紫丁香苷，10號(hào)峰為柯里拉京，11號(hào)峰為馬錢苷，16號(hào)峰為鞣花酸，20號(hào)峰為蛇床子素，見圖2，由于16號(hào)峰(鞣花酸)峰面積最大，分離度良好，故選擇其作為參考峰。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，依次倍量稀釋，分別吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.6.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批本品(批號(hào)191202)0.2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得沒食子酸、馬錢苷酸、紫丁香苷、柯里拉京、馬錢苷、鞣花酸、蛇床子素峰面積RSD分別為0.49%、0.49%、0.38%、0.55%、0.78%、0.48%、0.48%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批本品(批號(hào)191202)0.2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、馬錢苷酸、紫丁香苷、柯里拉京、馬錢苷、鞣花酸、蛇床子素峰面積RSD分別為0.70%、0.40%、0.37%、0.47%、0.44%、1.27%、0.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批本品(批號(hào)191202)0.2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、馬錢苷酸、紫丁香苷、柯里拉京、馬錢苷、鞣花酸、蛇床子素峰面積RSD分別為0.24%、0.33%、0.37%、0.26%、0.42%、0.93%、0.28%，表明溶液在室溫[(25±5)℃]下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品(批號(hào)191202)0.1 g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，加入對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒食子酸、馬錢苷酸、紫丁香苷、柯里拉京、馬錢苷、鞣花酸、蛇床子素平均加樣回收率分別為101.0%、100.1%、100.6%、99.1%、99.1%、101.5%、101.3%，RSD分別為1.89%、1.42%、1.71%、1.82%、1.58%、1.92%、1.96%。

2.7 樣品含量測(cè)定 精密稱取10批樣品，每批0.2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法各平行制備3份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果(μg/g, n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了不同色譜條件下流動(dòng)相組成，其中溶劑A選用甲醇、乙腈，發(fā)現(xiàn)前者洗脫時(shí)色譜圖上有更多峰；溶劑B選用純水、0.1%磷酸、0.2%磷酸、0.5%磷酸，發(fā)現(xiàn)0.2%磷酸洗脫時(shí)出現(xiàn)更多峰，在抑制峰拖尾、增加峰形對(duì)稱性方面更理想。再考察了柱溫30、35、40 ℃，發(fā)現(xiàn)在35 ℃下呈現(xiàn)出更好的色譜峰分離。最后，記錄了200～400 nm波長(zhǎng)處各成分紫外光譜，最終確定為254 nm，此時(shí)基線更穩(wěn)定，色譜峰更多。

方法學(xué)考察結(jié)果顯示，所建立的祛風(fēng)止痛膠囊HPLC指紋圖譜可行性高，可靠性強(qiáng)，并且10批樣品相似度均在0.986以上，表明不同批次之間具有良好的一致性，可作為該制劑實(shí)用的定性鑒定工具，并可用于評(píng)價(jià)其制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)性、均一性、穩(wěn)定性。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，祛風(fēng)止痛膠囊中馬錢苷酸含量最高，其次為柯里拉京、沒食子酸、蛇床子素、鞣花酸，馬錢苷，而紫丁香苷較低。目前，該制劑相關(guān)研究大多是在同一色譜條件下測(cè)定單一成分含量[14-18]，而本實(shí)驗(yàn)可同時(shí)測(cè)定上述7種成分含量，有助于全面控制其質(zhì)量，并能節(jié)約成本。