王超眾， 南俊伶， 董艷麗， 王萌萌,3*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾市藥品檢驗中心，黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

熱毒寧注射液是江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產的中藥注射劑[1]，由金銀花、梔子、青蒿3味藥材制成[2]，具有清熱、疏風、解毒的功效[3]，用于治療外感風熱所致感冒、咳嗽，上呼吸道感染、急性支氣管炎等疾病[4]，臨床上退熱作用迅速，抗病毒效果顯著[5-6]，屬于國家二類新藥[7-8]，并在治療急性氣管炎、上呼吸道感染方面取得了一定療效[9-11]。在新冠肺炎疫情流行期間，熱毒寧注射液已被廣泛應用于危重型患者的治療[12-15]，故有必要對該制劑進行嚴格的質量控制。

在熱毒寧注射液現(xiàn)行標準中，分別采用2個HPLC系統(tǒng)測定梔子苷、綠原酸的含量，操作繁瑣，另外還有應用高效毛細管電泳法[16]、紫外分光光度法[17]、高效液相色譜法[18-20]、超高效液相色譜法[21]等手段進行含量測定，但尚無關于超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜(UHPLC-MS/MS)法的相關報道。因此，本實驗建立UHPLC-MS/MS法同時測定熱毒寧注射液中梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸的含量，符合中藥質量控制標準的發(fā)展趨勢[22]，可為該制劑用藥安全提供可靠的技術保障。

1 材料

1.1 儀器 Thermo Vanquish H型高效液相色譜儀(配置Xcalibur 3.0.63工作站)、Thermo TSQ Quantum Access型質譜儀(配置Chromeleon 7.2.10工作站)(美國Thermo公司)；BP211D型電子天平(德國Sartorius公司，精度0.01 mg)；KQ-500VDV型臺式三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率45 kHz)；DFY-400型高速萬能粉碎機(上海比朗儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 梔子苷(批號110749-201919，純度97.1%)、綠原酸(批號110753-202018，純度96.1%)對照品(中國食品藥品檢定研究院)；京尼平龍膽雙糖苷(批號7382，純度≥98.0%)、新綠原酸(批號7864，純度≥98.0%)對照品(上海詩丹德標準技術服務有限公司)；隱綠原酸對照品(成都普思生物科技股份有限公司，批號PS14011403，純度≥99.0%)。熱毒寧注射液(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號210601、210824、190805)。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 UHPLC-MS/MS分析條件 ACES C18Dim色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相乙腈(A)-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～7 min，5%～25%A；7～9 min，25%～65%A；9～10 min，65%～100%A；10～12 min，100%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL；電噴霧離子源，正負離子檢測；選擇反應監(jiān)測(SRM)模式；霧化氣N2；鞘氣體積流量10 bar(1 bar=100 kPa)；輔助氣體積流量30 bar；源電壓4 000 V(+)、3 500 V(-)；毛細管溫度270 ℃，其他質譜參數(shù)見表1。

表1 各成分質譜參數(shù)

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸對照品適量，50%甲醇制成1 mg/mL溶液，分別精密量取適量，50%甲醇制成質量濃度分別為1.022 5、0.505 7、0.802 4、0.301 8、0.301 0 μg/mL的貯備液，分別精密量取2 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品1 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.2 mL，置于200 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 空白溶液 取50%甲醇，濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗 取“2.2”項下對照品、供試品、空白溶液適量，在“2.1”項條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖中各成分保留時間與對照品溶液一致，空白色譜圖無干擾峰出現(xiàn)，表明該方法系統(tǒng)適應性良好。

2.4 線性關系考察 取“2.2.1”項下貯備液，50%甲醇依次稀釋100、50、20、10、5、2.5、2倍，得到含梔子苷10.22、20.45、51.12、102.25、204.49、408.99、511.230 ng/mL，京尼平龍膽雙糖苷5.06、10.11、25.28、50.57、101.14、202.27、252.84 ng/mL，綠原酸8.02、16.05、40.12、80.24、160.49、320.97、401.22 ng/mL，新綠原酸3.02、6.04、15.09、30.18、60.37、120.74、150.92 ng/mL，隱綠原酸3.01、6.02、15.05、30.10、60.19、120.38、150.48 ng/mL的對照品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.5 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項條件下進樣測定6次，測得梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸峰面積RSD分別為1.21%、2.06%、1.07%、1.56%、0.97%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取本品(批號210601)適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、6、10、16、24 h在“2.1”項條件下進樣測定，測得梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸峰面積RSD分別為3.47%、4.26%、2.59%、2.67%、3.13%，表明溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 取本品(批號210601)適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行6份，在“2.1”項條件下進樣測定，測得梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量RSD分別為2.10%、1.69%、1.36%、2.08%、1.57%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取各成分含量已知的本品(批號210601)0.5 mL，共6份，置于50 mL量瓶中，分別精密加入“2.1”項下1 mg/mL溶液5、2.5、3.3、1.2、1.3 mL，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.2 mL，置于200 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，在“2.1”項條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定，外標法計算各成分含量，結果見表4。

表4 各成分含量測定結果(mg/mL，n=3)

3 討論

3.1 紫外檢測器、質譜檢測器比較 熱毒寧注射液組成復雜，雜質峰對主峰影響較大，并且5種成分檢測波長不同，紫外檢測器很難做到同時檢測。因此，本實驗采用質譜檢測器，可使結果更準確。

3.2 流動相選擇 本實驗考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-10 mmol/L醋酸銨、乙腈-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)，發(fā)現(xiàn)乙腈-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)洗脫時效果較好。

3.3 檢測離子選擇 梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷均為環(huán)烯醚萜類化合物[23]，在本實驗條件下得到1個氨基，形成m/z406.2、568.4的[M+NH4]+準分子離子峰，碰撞后裂解的二級質譜中m/z209.2峰響應值最高，即兩者共有子離子[C11O4H13]+；綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸主要為咖啡酸、香豆酸、福林酸與奎寧酸形成的縮合型酚酸，由于酯化部位及酸酐種類、數(shù)量的不同，使得綠原酸類物質形成了以上3種同分異構體[24]，在本實驗條件下易失去1個質子，形成m/z353.1的[M-H]-準分子離子峰，碰撞后裂解的二級質譜中m/z191.1峰響應值最高，即三者共有子離子[C7O6H11]-。

4 結論

本實驗采用UHPLC-MS/MS法同時測定熱毒寧注射液中梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸的含量，該方法準確可靠，重復性好，靈敏度高，可為該制劑質量控制提供依據(jù)。