王芝林， 于國(guó)英

(1.青海省第四人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室，青海 西寧 810000；2.青海省第四人民醫(yī)院肝病科，青海 西寧 810000)

結(jié)核病是當(dāng)今世界尤其是發(fā)展中國(guó)家的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，每年約有1 000萬(wàn)新發(fā)病例，是引起成年人死于傳染病的主要病因[1]。臨床主要通過(guò)利福平和異煙肼等抗結(jié)核藥物對(duì)結(jié)核病進(jìn)行治療，利福平和異煙肼的聯(lián)合使用能有效治療結(jié)核桿菌引起的結(jié)核病，然而長(zhǎng)期或大劑量使用會(huì)導(dǎo)致部分患者產(chǎn)生藥物性肝損傷，嚴(yán)重者可能導(dǎo)致肝衰竭，威脅患者健康[2]。目前藥物性肝損傷的發(fā)病機(jī)制尚不明確，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的去乙酰化酶，可通過(guò)抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)改善藥物性肝損傷[3]。丹參酮ⅡA是中藥丹參的主要有效成分之一，具有抗纖維化、抗癌、抗血管生成等多種作用，被用于心血管疾病、糖尿病、肝病等多種疾病的治療[4-5]。研究表明，丹參酮ⅡA對(duì)利福平導(dǎo)致的小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用[6]。本研究通過(guò)構(gòu)建抗結(jié)核藥物致小鼠肝損傷模型，探討丹參酮ⅡA對(duì)肝損傷小鼠的保護(hù)作用及對(duì)SIRT1/NF-κB信號(hào)通路的影響，以期了解丹參酮ⅡA在抗結(jié)核藥物致肝損傷中的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠72只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0009，于溫度22～25 ℃、相對(duì)濕度50%～70%、通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 丹參酮ⅡA(純度≥97%，貨號(hào)T4952)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；利福平膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字H51020786，批號(hào)20190125)，購(gòu)自成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司；異煙肼片(國(guó)藥準(zhǔn)字H31020494，批號(hào)20190624)，購(gòu)自上海上藥信誼藥廠有限公司。SRT1720、EX527(貨號(hào)S1129、S1541)，購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號(hào)AQ-M0183、EM0109)，購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、RIPA裂解液(貨號(hào)G1120、R0010)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)P0012)，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠SIRT1、NF-κB、β-actin一抗，山羊抗兔IgG H&L(貨號(hào)ab189494、ab32360、ab5694、ab6702)，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器 CA94089酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；BX51顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司；Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 60只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，丹參酮ⅡA低、高劑量組，SRT1720(SIRT1激活劑)組，丹參酮ⅡA+EX527(SIRT1抑制劑)組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組小鼠每天灌胃給予100 mg/kg 利福平和100 mg/kg 異煙肼[7]，對(duì)照組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)30 d。利福平、異煙肼灌胃后2 h，丹參酮ⅡA低、高劑量組小鼠給予10、50 mg/kg 丹參酮ⅡA灌胃[6]，SRT1720組小鼠給予20 mg/kg SRT1720灌胃[8]，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠給予50 mg/kg丹參酮ⅡA和10 mg/kg EX527灌胃[9]，對(duì)照組和模型組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)30 d。給藥期間，觀察小鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食飲水及活動(dòng)情況，并記錄體質(zhì)量變化。

2.2 取材 末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，取適量用于生化指標(biāo)檢測(cè)，剩余血清分裝后于-80 ℃冰箱保存。處死小鼠，無(wú)菌條件下摘取肝臟，生理鹽水沖洗，一部分置于10%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋；另一部分保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 小鼠血清肝功能、血脂及炎癥因子水平檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。取-80 ℃冰箱中保存的血清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 HE染色觀察小鼠肝組織病理學(xué)變化 取“2.2”項(xiàng)下石蠟包埋的肝組織，石蠟切片機(jī)切片(4 μm)，脫蠟至水，HE染色，顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)，并進(jìn)行病理學(xué)損傷評(píng)分。肝組織病理學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝竇充血、門(mén)管區(qū)水腫4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分(無(wú)病變或非常輕微為0分，輕度病變?yōu)?分，重度病變?yōu)?分，極重度病變?yōu)?分)，各項(xiàng)評(píng)定分?jǐn)?shù)總和為最終肝組織病理學(xué)損傷評(píng)分，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野，取平均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.5 免疫組化檢測(cè)小鼠肝組織SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá) 取“2.2”項(xiàng)下石蠟包埋的肝組織，石蠟切片機(jī)切片(4 μm)，60 ℃烤箱烘干，常規(guī)脫蠟、水化后抗原修復(fù)，加入兔抗鼠SIRT1、NF-κB一抗，4 ℃過(guò)夜，加入山羊抗兔IgG H&L二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇短暫分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察SIRT1、NF-κB陽(yáng)性表達(dá)(棕黃色)。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)區(qū)域，Image J圖像分析軟件測(cè)定光密度。

2.6 Western blot法檢測(cè)小鼠肝組織中SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá) 取“2.2”項(xiàng)下于-80 ℃冰箱中保存的小鼠肝組織，加入RIPA組織裂解液，冰上勻漿，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，在95 ℃下變性，配制10%分離膠，5%濃縮膠，取10 μL樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜3次，加入兔抗鼠SIRT1、NF-κB、β-actin一抗稀釋液，在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入山羊抗兔H&L IgG二抗稀釋液，室溫孵育，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J圖像處理軟件分析蛋白條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況 對(duì)照組小鼠毛發(fā)整齊干凈，進(jìn)食飲水、活動(dòng)正常，體質(zhì)量增加規(guī)律；模型組小鼠毛發(fā)稀疏蓬亂，精神萎靡，活動(dòng)量減少，進(jìn)食飲水量下降，體質(zhì)量增加不明顯或下降；丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠活動(dòng)、進(jìn)食飲水情況較模型組有所改善；而丹參酮ⅡA+EX527組小鼠狀態(tài)較丹參酮ⅡA高劑量組稍差。

3.2 丹參酮ⅡA對(duì)小鼠血清肝功能及血脂水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低(P<0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高(P<0.01)；與丹參酮ⅡA高劑量組比較，SRT1720組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清肝功能及血脂水平比較

3.3 丹參酮ⅡA對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)變化及病理學(xué)損傷評(píng)分的影響 對(duì)照組小鼠肝組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，無(wú)病變發(fā)生，肝細(xì)胞排列均勻；模型組小鼠肝小葉受到破壞，肝索排列紊亂，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，病理?yè)p傷評(píng)分高于對(duì)照組(P<0.01)；丹參酮ⅡA低劑量組小鼠肝組織損傷程度降低，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)變輕，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，病理?yè)p傷評(píng)分低于模型組(P<0.01)；丹參酮ⅡA高劑量組和SRT1720組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝索排列較為整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度和細(xì)胞壞死減輕，病理?yè)p傷評(píng)分均低于模型組(P<0.01)，且2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而丹參酮ⅡA+EX527組小鼠肝組織損傷程度重于丹參酮ⅡA高劑量組(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表2。

表2 各組小鼠病理?yè)p傷評(píng)分比較

3.4 丹參酮ⅡA對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.01)；與丹參酮ⅡA高劑量組比較，SRT1720組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，丹參酮ⅡA+EX527組血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較

3.5 丹參酮ⅡA對(duì)小鼠肝組織SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響 小鼠肝組織SIRT1主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，NF-κB在細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)均有表達(dá)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織SIRT1陽(yáng)性表達(dá)降低(P<0.01)，NF-κB陽(yáng)性表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠肝組織SIRT1陽(yáng)性表達(dá)升高(P<0.01)，NF-κB陽(yáng)性表達(dá)降低(P<0.01)；與丹參酮ⅡA高劑量組比較，SRT1720組小鼠肝組織SIRT1、NF-κB陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠肝組織SIRT1陽(yáng)性表達(dá)降低，NF-κB陽(yáng)性表達(dá)升高(P<0.01)，見(jiàn)表4、圖2。

表4 各組小鼠肝組織SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)比較

3.6 丹參酮ⅡA對(duì)小鼠肝組織SIRT1/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，NF-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，NF-κB蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與丹參酮ⅡA高劑量組比較，SRT1720組小鼠肝組織SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，NF-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，見(jiàn)表5、圖3。

表5 各組小鼠肝組織SIRT1/NF-κB通路蛋白表達(dá)比較

4 討論

利福平和異煙肼是臨床上治療結(jié)核病的主要藥物，兩者長(zhǎng)期聯(lián)合使用會(huì)引起藥物性肝損傷的發(fā)生[10-11]。本研究通過(guò)利福平和異煙肼聯(lián)合灌胃構(gòu)建抗結(jié)核藥物致肝損傷小鼠模型，探討藥物性肝損傷小鼠治療相關(guān)機(jī)制，結(jié)果表明，模型組小鼠血清ALT、AST、TBIL水平升高，且肝組織中肝小葉受到破壞，肝索排列紊亂，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，提示造模成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

丹參酮ⅡA具有抗炎、抗氧化、抗菌等多種生物學(xué)活性，可用于多種肝臟疾病的治療[12-13]。研究表明TNF-α、IL-1β的表達(dá)與藥物性肝損傷、免疫性肝損傷等肝臟疾病發(fā)生有關(guān)[14-15]。本研究結(jié)果提示，炎癥與利福平和異煙肼引起的藥物性肝損傷的發(fā)生有關(guān)。Huang等[16]研究表明丹參酮ⅡA能夠抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷大鼠的炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡，改善大鼠肝損傷。Zhang等[17]研究表明丹參酮ⅡA通過(guò)改變乙酰氨基酚及其代謝產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，防止乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠肝毒性。Yang等[18]研究表明丹參酮ⅡA能夠減輕利福平誘導(dǎo)的膽汁淤積引起的大鼠肝損傷。本研究結(jié)果提示，丹參酮ⅡA對(duì)藥物性肝損傷可能有一定的治療效果。進(jìn)一步研究表明，丹參酮ⅡA可能通過(guò)抑制利福平聯(lián)合異煙肼引起的炎癥反應(yīng)，減輕小鼠肝損傷，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

SIRT1參與炎癥反應(yīng)、物質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)途徑[19]。NF-κB是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，參與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[20]。SIRT1通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗炎作用[21]。Niu等[22]研究表明SIRT1的上調(diào)通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路防止高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。本研究結(jié)果表明，SIRT1/NF-κB信號(hào)通路可能與抗結(jié)核藥物引起的肝損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)激活SIRT1/NF-κB信號(hào)通路有助于改善利福平聯(lián)合異煙肼導(dǎo)致的小鼠肝損傷。Quan等[23]認(rèn)為丹參酮ⅡA可能通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB信號(hào)通路保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺損傷。本研究結(jié)果提示，丹參酮ⅡA可能促進(jìn)SIRT1/NF-κB信號(hào)通路的激活。本研究還發(fā)現(xiàn)，與丹參酮ⅡA高劑量組比較，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)降低，NF-κB蛋白表達(dá)升高，且小鼠血清炎癥因子水平升高，肝損傷程度加重，進(jìn)一步說(shuō)明丹參酮ⅡA通過(guò)激活SIRT1/NF-κB信號(hào)通路，減輕抗結(jié)核藥物導(dǎo)致小鼠肝損傷。

綜上所述，丹參酮ⅡA可能通過(guò)激活SIRT1/NF-κB信號(hào)通路，抑制利福平和異煙肼聯(lián)合導(dǎo)致的小鼠炎癥反應(yīng)，減輕小鼠肝損傷，這可能是丹參酮ⅡA在治療藥物性肝損傷中的相關(guān)機(jī)制。本研究為臨床使用丹參酮ⅡA防治抗結(jié)核藥物引起的肝損傷提供了理論依據(jù)。