楊欣怡， 戴國(guó)梁， 陳閃閃， 賈可可， 歐陽(yáng)冰琛， 居文政

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

交泰丸出自明代《韓氏醫(yī)通》，由黃連、肉桂組成，方名出自清代王士雄的《四科簡(jiǎn)要方·安神》[1]?，F(xiàn)代研究表明，交泰丸配伍比例以黃連-肉桂(10∶1)時(shí)抗抑郁效果最好[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，交泰丸主要成分有表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、肉桂醛等，其中鹽酸小檗堿含量最高[3]。

近年來(lái)，小檗堿因其在鎮(zhèn)靜催眠[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]等方面的生理活性被廣泛關(guān)注，但單體存在水溶性和口服吸收差、生物利用度低等不足[6]。目前，對(duì)小檗堿藥動(dòng)學(xué)的研究大多集中在口服單體小檗堿[7]或含有小檗堿的中藥提取物(如黃連、黃柏[8-9]等)，而對(duì)于兩者的對(duì)比研究較少。近年來(lái)，受中醫(yī)學(xué)說(shuō)啟發(fā)，對(duì)中藥成分相互作用的研究較多，課題組前期考察交泰丸中小檗堿藥動(dòng)學(xué)與其他共存成分的關(guān)系，從物質(zhì)基礎(chǔ)層面提出可有效增強(qiáng)該成分生物利用度的方法。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃給予健康大鼠交泰丸水提液、小檗堿單體，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法檢測(cè)小檗堿血藥濃度，從而比較該成分藥動(dòng)學(xué)，為交泰丸配伍理論和臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀、Quattro Premier三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配置電噴霧化離子源(ESI)、色譜工作站Masslynx 4.0(美國(guó)Waters公司)；AE240電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；MICRO-17R冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；WH-3微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；A10超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物

1.2.1 交泰丸水提液 黃連(批號(hào)20200801-01)、肉桂(批號(hào)20200801-01)飲片均購(gòu)自貴州同德藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部副主任中藥師張倩鑒定為正品。根據(jù)課題組前期報(bào)道的方法[10]自制交泰丸，其水提液質(zhì)量濃度為1.1 g/mL(即每1 mL藥液含1.1 g原藥材)，小檗堿含量為56.76 mg/mL[3]，置于冰箱中備用。

1.2.2 小檗堿混懸劑 取一定量小檗堿片(成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)200704，0.1 g/片)，稱取總質(zhì)量后計(jì)算平均片重，于研缽中研成細(xì)粉，精密稱取適量，0.5% CMC-Na溶液配成混懸劑(小檗堿含量為56.76 mg/mL)，置于冰箱中備用。

1.2.3 試劑 小檗堿(批號(hào)MUST-16031814，純度98.95%)、延胡索乙素(批號(hào)MUST-16030905，純度98%)對(duì)照品均購(gòu)于曼斯特(成都)生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 動(dòng)物 12只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(170±10)g，購(gòu)自南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2019-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)(編號(hào)2021DW-17-01)。

2 方法

2.1 LC-MS/MS分析條件

2.1.1 色譜 Agilent ZOBAX SB C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.2%甲酸(45∶55)；體積流量0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；噴霧電壓3 000 V；離子源溫度350 ℃；正離子檢測(cè)；小檗堿m/z336.0～320.0(錐孔電壓40 V，碰撞電壓30 V)；內(nèi)標(biāo)(延胡索乙素)m/z356.1～191.9(錐孔電壓30 V，碰撞電壓32 V)。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取小檗堿對(duì)照品適量，甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度為1.38 mg/mL的溶液，精密吸取適量，甲醇依次稀釋至4.49、6.74、13.48、26.95、53.91、107.81、215.63 ng/mL，精密吸取適量，甲醇進(jìn)一步稀釋至11.32、33.97、169.85 ng/mL，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品適量，甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度為1.17 mg/mL的溶液，精密吸取適量，甲醇稀釋至4.82 ng/mL，即得。

2.3 血漿樣品處理 將冷凍保存的血漿樣品在室溫下解凍，短暫渦旋混合，精密吸取50 μL空白血漿或含藥血漿至1.5 mL EP管中，依次加入內(nèi)標(biāo)、對(duì)照品溶液(含藥血漿更換為純甲醇)各10 μL，渦旋混勻30 s，加入150 μL乙腈，振蕩3 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液10 μL至具內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.4 分組、給藥與采血 大鼠按體質(zhì)量均衡和隨機(jī)的原則分為交泰丸組和小檗堿組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，分別灌胃給予交泰丸水提液3 g/kg、小檗堿混懸劑154.8 mg/kg(以小檗堿計(jì)，與交泰丸水提液給藥量保持一致)，于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h眼球后靜脈叢采血各0.3 mL，置于1.5 mL肝素化試管中，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上層血漿，保存于-80 ℃冰箱中。

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗(yàn) 取空白大鼠血漿、空白大鼠血漿+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)、交泰丸水提液給藥5 min后血漿樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，小檗堿、內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為2.17、1.91 min，兩者分離度和峰形良好，無(wú)內(nèi)源性干擾，表明該方法專屬性良好。

3.2 線性關(guān)系考察 取50 μL空白大鼠血漿，加入對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以小檗堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，小檗堿、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.019 26X+0.001 028(r=0.998 2)，在0.90～43.13 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.90 ng/mL。

3.3 精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取50 μL空白大鼠血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，制成定量下限及低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品(分別含0.9、2.26、6.79、33.97 ng/mL小檗堿)，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表1，可知該方法精密度、準(zhǔn)確度良好。

表1 小檗堿精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3.4 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 精密吸取低、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，依次加入純水50 μL、乙腈150 μL，渦旋3 min，吸取50 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄小檗堿峰面積(As)C、內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)C及其平均值-(As)C、-(Ai)C(n=6)，按“2.3”項(xiàng)下方法提取空白血漿溶液(不加內(nèi)標(biāo))，離心后同法操作，計(jì)算兩者基質(zhì)效應(yīng)因子MFs、MFi及內(nèi)標(biāo)歸一化后基質(zhì)效應(yīng)因子MF，公式分別為MFs=[As/-(As)C]×100%、MFi=[Ai/-(Ai)C]×100%、MF=(MFs/MFi)×100%，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，血漿中小檗堿基質(zhì)效應(yīng)均小于15%，符合生物樣品分析要求。

表2 小檗堿基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

3.5 提取回收率 取50 μL空白大鼠血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，制成低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄小檗堿峰面積(As)B、內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)B。按“3.4”項(xiàng)下方法處理，得到空白血漿溶液，加入不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，再加入空白血漿200 μL，渦旋混勻3 min，吸取50 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄兩者峰面積(As)A、(Ai)A及其平均值-(As)A(n=6)、-(Ai)A(n=18)，計(jì)算提取回收率Recs、Reci，公式分別為Recs=[(As)B/-(As)A]×100%、Reci=[(Ai)B/-(Ai)A]×100%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 小檗堿、內(nèi)標(biāo)提取回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取50 μL空白大鼠血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，制成低、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，分別在室溫下放置6 h、-80 ℃下放置60 d、反復(fù)凍融3次、-20 ℃下放置72 h、自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h后，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，小檗堿穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求。

表4 小檗堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表5 小檗堿主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

4 討論

小檗堿與表小檗堿為同分異構(gòu)體，由于兩者具有相同的母離子和子離子，在質(zhì)譜檢測(cè)上共用一個(gè)離子通道，故需在色譜上將其進(jìn)行分離。本實(shí)驗(yàn)選擇了流動(dòng)相乙腈-0.2%甲酸(45∶55)，體積流量0.25 mL/min，在該檢測(cè)條件下，2個(gè)同分異構(gòu)體能很好地分離，不影響小檗堿的檢測(cè)。再比較了0.1%、0.2%、0.3%甲酸，發(fā)現(xiàn)0.2%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，小檗堿的響應(yīng)最強(qiáng)，峰形最優(yōu)。

本研究對(duì)交泰丸水提液和小檗堿單體在相同條件下進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果表明，兩者藥動(dòng)學(xué)行為存在明顯差異。從圖2中可以看出，大鼠灌胃給予小檗堿單體時(shí)，在達(dá)到峰濃度后隨即大幅下降，而且血藥濃度長(zhǎng)期處于較低水平，與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致；交泰丸水提液組在達(dá)到峰濃度后并未立刻大幅下降，而是維持在較高濃度水平。大鼠灌胃給予交泰丸水提液后，與口服等量小檗堿單體比較，其曲線下面積AUC0-t及末端消除半衰期t1/2分別提高了1.23、1.28倍，提示以交泰丸水提液的方式給藥，小檗堿的生物利用度更高。正如中藥復(fù)方中的藥輔共生理論[11]，輔藥在藥方中未必起治主癥的作用，但卻可使君藥的吸收增大，消除速率減慢，表觀生物利用度提高。有研究表明，肉桂能提高黃連小檗堿的的生物利用度，黃連粉末中其他成分也可能對(duì)小檗堿的吸收和代謝發(fā)揮著積極影響，提示交泰丸水提液中其他化學(xué)成分的相互作用可能是使小檗堿生物利用度增加的原因[12]。另外，2組血藥濃度-時(shí)間曲線均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，表明小檗堿在吸收過(guò)程中會(huì)受到肝腸循環(huán)的影響，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。

交泰丸具有交通心腎、鎮(zhèn)靜安神的作用，臨床上常用于治療失眠[14]、抑郁癥[15]。研究表明，交泰丸中小檗堿可以穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入海馬組織發(fā)揮作用，減少小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)的時(shí)間，并能使全腦中去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺的含量增加，從而起到類似于地昔帕明、麥普替林、氟西汀等藥物的抗抑郁作用[16]。小檗堿是交泰丸主要成分，也具有抗抑郁的療效[17-18]，其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)可能會(huì)影響到交泰丸發(fā)揮抗抑郁的效果。本研究后續(xù)會(huì)進(jìn)一步開(kāi)展交泰丸水提液、單體小檗堿在慢性溫和不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激抑郁大鼠模型中抗抑郁效果的比較研究，以期為臨床抗抑郁治療的合理用藥提供數(shù)據(jù)參考。