鄧 暢， 成 銘， 薛 蓉， 張科衛(wèi)， 陸兔林， 毛春芹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，其性味辛、甘、大熱，功效回陽救逆、補火助陽、散寒止痛等[1]，主要含有生物堿、黃酮、多糖[2-4]等成分，具有抗心律失常、提高免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛[5-7]等藥理活性。目前，對附子成分的研究主要集中在生物堿，而且大多對藥材或相關(guān)飲片用有機溶劑超聲提取后進行分析，鮮有涉及其水溶性物質(zhì)。一般來說，傳統(tǒng)中藥都是以水煎煮制成湯劑后入藥，故為了保證臨床用藥安全有效，本實驗對淡附片炮制前后水煎液化學(xué)成分進行分析，同時對其顏色進行客觀量化研究，以期為該藥材質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

高效液相色譜儀，配置PDA檢測器、Empower工作站(型號Waters e2695，美國Waters公司)；分光測色計(型號CM-5，日本柯尼卡美能達公司)；電子分析天平(型號AG285，瑞士梅特勒-托利多公司)；高速離心機(型號H1650-W，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；超聲波清洗器(型號KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司)。

苯甲酰新烏頭堿(批號111795-201604)、苯甲酰烏頭原堿(批號111794-201705)、苯甲酰次烏頭堿(批號111796-201705)、烏頭堿(批號110720-201111)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；新烏頭堿(批號19022202)、甘草苷(批號Y12A8H41703)、次烏頭堿(批號19050902)對照品均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；其他試劑均為分析純；水為純凈水(娃哈哈集團有限公司)。

生附子共10批，由四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司提供(產(chǎn)地云南、四川，編號BEFORE-01～BEFORE-10)；甘草飲片購于南京先聲藥店；黑豆(批號994202224)購于蘇果超市有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源鑒定專家陳建偉教授鑒定為正品，均符合2020年版《中國藥典》要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備 參照2020年版《中國藥典》附子項下“淡附片”炮制方法，編號AFTER-01～AFTER-10。

2.2 炮制前后色澤量化研究

2.2.1 色澤測定 采用分光測色計對炮制前后色澤進行客觀綜合評價，每批樣品取3份，每份測定3次，取平均值，采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，并建立鑒別模型。選擇顏色參數(shù)L*，a*，b*進行考察，分別代表亮度、紅綠色度值、黃藍色度值[8]，L*越大，明度越大，越感到白；a*越大，顏色越偏紅；b*越大，顏色越偏黃。

2.2.2 測定條件 光源D65；照明系統(tǒng)SCE；口徑8 mm；區(qū)域30 mm；檢測波長360～740 nm；標(biāo)準(zhǔn)觀察角度10°。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 精密度試驗 取同一批樣品，在“2.2.2”項條件下測定6次，測得L*、a*、b*RSD均小于1.39%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品，采用連續(xù)開機及每次測量后均關(guān)機的方法，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.2.2”項條件下測定，測得L*，a*，b*RSD均小于1.24%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.3 外界光亮強度對色澤測定穩(wěn)定性的影響 取同一批樣品，同一天內(nèi)在6：00、9：00、12：00、15：00、18：00、21：00在“2.2.2”項條件下測定，測得L*、a*、b*RSD均小于1.21%，表明不同外界光亮強度對測定結(jié)果影響不大，方法穩(wěn)定性良好。

2.2.4 色澤值參考范圍建立 采用SPSS 21.0軟件對炮制前后顏色數(shù)據(jù)進行分析，通過探索性分析進行多元正態(tài)性檢驗，以P>0.05為符合正態(tài)分布的檢驗標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)不滿足多元正態(tài)分布，故參考值范圍選擇百分位數(shù)法，以中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)色值，建立標(biāo)準(zhǔn)色差值ΔE，計算公式為ΔE=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2，其中ΔL*、Δa*、Δb*是各顏色參數(shù)最大值與中位數(shù)的差值。

采用描述性統(tǒng)計分析中的頻數(shù)統(tǒng)計法，計算顏色參數(shù)P5、P95百分數(shù)指標(biāo)，得到兩者雙側(cè)90%區(qū)間的色值范圍，結(jié)果見表1。由此可知，在90%色澤值范圍內(nèi)L*、a*、b*均存在差異表明炮制前后色澤存在很大差異。

表1 炮制前后顏色標(biāo)準(zhǔn)范圍

2.2.5 多組比較秩和檢驗 為了驗證所建立的顏色范圍的合理性，采用非參數(shù)檢驗項下獨立樣本檢驗對炮制前后顏色數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果，秩和檢驗、中位數(shù)檢驗中L*、a*、b*的P值均小于0.001，故拒絕H0，接受H1，可對炮制前后顏色變化進行客觀比較。

2.2.6 秩相關(guān) 由于炮制前后原始顏色數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，故采用秩相關(guān)分析。結(jié)果，L*、a*、b*Spearman相關(guān)系數(shù)分別為-0.114、-0.212、-0.318，雙側(cè)P值分別為0.550、0.261、0.087，故接受H0。可認為炮制前后三者之間無相關(guān)性，即色值有明顯差異。

2.2.7 判別分析 將采集到的數(shù)據(jù)進行分類，其中1類(Y1)炮制前，2類(Y2)為炮制后，采用判別分析建立以顏色數(shù)據(jù)來表征的Fisher線性判別函數(shù)，分別為Y1=156.993L*+616.420a*-119.307b*-5 631.018、Y2=133.832L*+521.381a*-96.583b*-4 141.005，將炮制前后樣品的顏色參數(shù)代入上述判別函數(shù)中計算Y1、Y2，如果前者數(shù)值較大，則為炮制前樣品；如果后前者數(shù)值較大，則為炮制后樣品，結(jié)果見表2。由此可知，炮制前后判別函數(shù)正確率均為100%，即該模型可對交叉驗證中所有案例進行正確分類，準(zhǔn)確率良好。

表2 判別分析結(jié)果

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.04 mol/L醋酸銨(B)，梯度洗脫(0～6 min，5～13%A；6～10 min，13～16%A；10～24 min，16～18%A；24～25 min，18～23%A；25～44 min，23%A；44～54 min，23～32%A；54～76 min，32～50%A；76～82 min，50～83%A；82～85 min，83～100%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長235 nm；進樣量10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、甘草苷對照品適量，制成質(zhì)量濃度分別為60.92、9.90、9.92、5.79、4.91、4.52、24.10 μg/mL的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取本品約5 g，精密稱定，放入砂鍋中，加50 mL水煎煮30 min，濾過，蒸干濾液，殘渣中加入3 mL氨試液，精密加入50 mL異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液，稱定錐形瓶質(zhì)量，超聲(功率300 W，頻率40 kHz，水溫25 ℃以下)處理30 min，放冷，上述混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取25 mL濾液，減壓回收溶劑至干(溫度低于40 ℃)，將殘留物溶于3 mL上述混合溶液中，濾過，取濾液，即得。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 空白實驗 精密吸取異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，發(fā)現(xiàn)溶液對測定結(jié)果無干擾。

2.3.4.2 精密度試驗 精密稱取炮制前后樣品(BEFORE-01、AFTER-01)適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下各進樣測定6次，以苯甲酰新烏頭堿為參照，測得炮制前后各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于1.61%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取炮制前后樣品(BEFORE-01、AFTER-01)各6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，以苯甲酰新烏頭堿為參照，測得炮制前后各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于1.34%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取炮制前后樣品(BEFORE-01、AFTER-01)適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，以苯甲酰新烏頭堿為參照，測得炮制前后各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于1.58%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 圖譜生成及相似度評價 取炮制前后樣品各10批，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，將其色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”(2012版)，作為參照圖譜，采用平均數(shù)法、多點校正、色譜峰匹配，見圖1～3，再進行相似度分析，結(jié)果見表3。由此可知，炮制前后10批樣品指紋圖譜相似度均分別大于0.90、0.95，表明同一批樣品色譜峰基本相似。

表3 炮制前后各批樣品相似度

另外，炮制前后HPLC指紋圖譜中均有25個共有峰，其中21個為炮制前后均存在(峰1～6、9～11、13、14、16～20、22、23、25、27、29)，15號峰為炮制前樣品特征峰，7、8、12、28號峰為炮制后樣品特征峰(其中7號峰為甘草苷)，7、13、14、16、24、25、26號峰分別為甘草苷、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿。綜上所述，炮制后水煎液中化學(xué)成分發(fā)生了變化，產(chǎn)生了特有成分，但同時也保留了炮制前大部分成分。

3 討論

3.1 研究必要性 目前，國內(nèi)外文獻尚未涉及淡附片炮制前后水煎液，有學(xué)者嘗試建立其特征圖譜，但僅研究了70%甲醇提取部位[3]。附子為有毒中藥，為了保證其安全有效，需對其水煎液進行研究。

3.2 提取條件優(yōu)化 附子生物堿既是有毒成分，又是有效成分，故本實驗對其進行研究，并對提取方法、提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)、液料比進行考察，最終確定為“2.3.3”項下提取條件。

3.3 色譜條件優(yōu)化 本實驗比較了流動相甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.04 mol/L醋酸銨、乙腈-0.04 mol/L醋酸銨等及不同梯度洗脫程序，考察了不同柱溫、進樣量、色譜柱對各成分色譜行為的影響，最終確定為“2.3.1”項下色譜條件。

4 結(jié)論

分光測色計可量化傳統(tǒng)的色澤描述指標(biāo)，避免了傳統(tǒng)色澤鑒別中的主觀因素干擾，已被廣泛應(yīng)用于食品、中藥、牙科材料等多個領(lǐng)域[9-12]，而在中藥方面往往用于不同炮制品、不同產(chǎn)地藥材的色澤分析[13-15]。本實驗采用該儀器來建立能客觀評價淡附片炮制前后色澤的模型，從而為客觀評價該藥材質(zhì)量提供了依據(jù)，同時也對臨床用藥安全性進行了有益的探索。

然后，本實驗分析了淡附片炮制前后水煎液中化學(xué)成分的差異，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了7、8、12、28號峰(其中7號峰為甘草苷)，并且15號峰未檢出，推測可能是加水、加熱、輔料炮制等因素所致[16]。