劉曉敏， 朱雯婷， 李玉婷， 賈夢(mèng)磊， 嚴(yán)鵬科

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣東省廣州市510145)

結(jié)直腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第二大原因[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多階段、多要素的病理過程，其發(fā)病原因復(fù)雜，至今尚不完全明確。阿托伐他汀鈣(atorvastatin calcium,AC)是他汀類藥物，除降脂作用外，也具有一定抗結(jié)直腸癌的作用[2-3]。盡管阿托伐他汀鈣具有良好的體外抗腫瘤作用，但其細(xì)胞抑制所需劑量遠(yuǎn)高于臨床治療劑量，導(dǎo)致臨床上需要給予較高劑量AC才可達(dá)到相同的抗腫瘤效果[4]。而口服AC首次代謝效應(yīng)高，生物利用度低，水溶性差，限制了其臨床應(yīng)用[5]。脂質(zhì)體作為藥物載體具有改善疏水藥物的水溶性、延長藥物釋放時(shí)間、提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性和改善體內(nèi)藥物分布等優(yōu)點(diǎn)[6]。本文構(gòu)建了阿托伐他汀鈣脂質(zhì)體(atorvastatin calcium liposome,ACL)，并研究ACL對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

阿托伐他汀鈣、膽固醇、大豆卵磷脂(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；HCT116細(xì)胞(武漢普諾賽生物科技有限公司)；三氯甲烷(西隴科學(xué)股份有限公司)；0.22 μm微孔過濾器(Millipore公司)；香豆素6(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)；1%結(jié)晶紫染料(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基(康寧公司)；血清(上海ExCell公司)；Transwell(美國BD公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90粒徑儀(英國Malvern公司)；透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；紫外分光光度計(jì)(日本島津公司UV-1780)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司Elx808)；倒置顯微鏡(日本尼康公司)；共聚焦顯微鏡(日本尼康公司A1)。

1.2 ACL的制備

采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備ACL[7]。稱取180 mg大豆卵磷脂，20 mg膽固醇，20 mg AC加至2 mL三氯甲烷中溶解，將油相逐滴滴入攪拌的25 mL去離子水中，攪拌速度450 r/min，溫度25 ℃，連續(xù)攪拌1.5 h。用細(xì)胞超聲破碎儀，功率150 W，超聲50次，每次3 s，通過0.22 μm濾膜過濾除去未包載的AC，得到ACL。以香豆素6(coumarin-6,Cou-6)為熒光探針探究HCT116細(xì)胞對(duì)藥物的攝取；采用相同的方法制備香豆素6脂質(zhì)體(Cou-6/Lps)。

1.3 ACL的表征觀察

Zetasizer Nano ZS90粒徑儀測(cè)定ACL的平均粒徑和Zeta電位。采用光散射法測(cè)量粒徑，采用強(qiáng)度分布對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。Zeta電位在25 ℃下分析。在透射電子顯微鏡下觀察ACL的形態(tài)。適當(dāng)稀釋脂質(zhì)體溶液，吸取適當(dāng)脂質(zhì)體溶液于碳網(wǎng)上，靜置5 min，用2%磷鎢酸(PTA)染色5 min，濾紙吸收多余溶液，自然干燥，觀察其表面形態(tài)和分布情況。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定ACL在246 nm波長下的光密度，計(jì)算ACL的包封率(EE)和載藥率(DL)。EE(%)=截留藥量/總給藥量×100%；DL(%)=截留藥量/(總給藥量+膜材質(zhì)量)×100%[8]。

1.4 ACL的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

收集4 ℃或25 ℃下不同時(shí)間(0、4、8、12、24、48、72、96、120 h)ACL，加入甲醇稀釋脂質(zhì)體使脂質(zhì)體破裂，藥物釋放，紫外分光光度計(jì)測(cè)定246 nm波長下光密度，依據(jù)AC標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算藥物質(zhì)量濃度。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HCT116細(xì)胞在含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件為37 ℃、5%CO2。將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(Control組)、阿托伐他汀鈣組(AC組)、阿托伐他汀鈣脂質(zhì)體組(ACL組)。Control組細(xì)胞不進(jìn)行處理；AC組、ACL組分別用2.5 mg/L AC、ACL干預(yù)[9]。

1.6 HCT116細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用共聚焦顯微鏡，將HCT116細(xì)胞5×104個(gè)/孔接種于共聚焦小皿上。次日，分別與無血清培養(yǎng)基配制的10 mg/L Cou-6/Lps和Cou-6共孵育1、2 h。結(jié)束后，PBS洗凈，室溫下用4%多聚甲醛固定15 min。用PBS徹底清洗共聚焦小皿，DAPI避光處理2 min，PBS封片，并在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 MTT法

HCT116細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)箱孵育過夜。分別加入不同質(zhì)量濃度(0.3、0.6、1.3、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L)ACL或AC，48 h后加入100 μL MTT溶液(0.5 g/L)，培養(yǎng)箱孵育4 h。移去上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，低速震蕩10 min。使用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)量光密度(OD)。細(xì)胞增殖率(%)=藥物處理組OD/空白組OD×100%。

1.8 細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)

HCT116細(xì)胞以1×103個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)箱孵育過夜，分別加入ACL或AC。每隔兩天進(jìn)行換液，直至細(xì)胞形成一定體積的克隆球。棄去原有培養(yǎng)基，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定15 min，加入1%結(jié)晶紫染色30 min，水洗去除多余染料，晾干并進(jìn)行拍照，采用Image J軟件處理圖片。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

HCT116細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于Transwell內(nèi)室中，分別加入ACL或AC，放置于含有700 μL 10%FBS培養(yǎng)基的24孔板中孵育。24 h后，移去小室內(nèi)液體，4%多聚甲醛固定15 min，用棉簽擦拭內(nèi)室細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色30 min，水洗除去多余染料。采用倒置顯微鏡觀察遷移的細(xì)胞并拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ACL的表征及穩(wěn)定性

ACL平均粒徑(87.24±0.485) nm，分散系數(shù)0.240～0.250，Zeta電位(-12.19±3.642) mV。透射電鏡觀察到脂質(zhì)體形態(tài)似球形或圓形結(jié)構(gòu)，外觀完整，且大小均勻，粒徑與粒度儀檢測(cè)粒徑相近(圖1A、B、C)。ACL包封率為97.47%±0.35%，載藥率為8.8%±3.8%，具有較高的包封率和載藥率。

在不同溫度下，隨著時(shí)間的延長，藥物質(zhì)量濃度剛開始下降較大，但后續(xù)并沒有很大的改變，ACL具有較好的穩(wěn)定性(圖1D)。

2.2 脂質(zhì)體納米載藥系統(tǒng)增加HCT116細(xì)胞攝取

在1、2 h時(shí)，與Cou-6相比，Cou-6/Lps組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，細(xì)胞攝取明顯增多，提示脂質(zhì)體納米載藥系統(tǒng)可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，增加細(xì)胞內(nèi)藥物質(zhì)量濃度(圖2)。

圖2 脂質(zhì)體納米載藥系統(tǒng)增加HCT116細(xì)胞攝取(熒光染色，800×)

2.3 ACL抑制HCT116細(xì)胞增殖

ACL組和AC組細(xì)胞增殖率呈劑量依賴性下降，且ACL的抑制作用明顯強(qiáng)于AC(圖3)。

圖3 ACL和AC對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

2.4 ACL抑制HCT116細(xì)胞克隆形成與遷移

與Control組比較，ACL組、AC組克隆形成率均降低，且ACL組低于AC組(P<0.01)；與Control組比較，AC組、ACL組細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少(P<0.01)，且ACL組細(xì)胞遷移數(shù)明顯少于AC組(P<0.05；圖4)。

3 討 論

Cai等[10]研究發(fā)現(xiàn)，AC抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。AC和根皮素通過協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期聯(lián)合抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長[11]。但因AC臨床劑量及水溶性低等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景不佳。脂質(zhì)體具有生物膜相似結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性等特性，作為遞送系統(tǒng)在藥物開發(fā)中越來越有吸引力[12-13]。Liu等[14]將紫杉醇和阿霉素共同包載在單個(gè)交聯(lián)多層脂質(zhì)體囊泡中，極大地增加了兩個(gè)藥物的包載率和緩釋效果，提高了藥物聯(lián)用效果。Kim等[15]將利妥昔單抗封裝在脂質(zhì)體內(nèi)部，然后在腫瘤部位釋放可以顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的消融。上述結(jié)果表明脂質(zhì)體為抗腫瘤藥物提供了一種有效的藥物遞送系統(tǒng)。

本研究制備了ACL，通過對(duì)其粒徑、Zeta電位、穩(wěn)定性和形態(tài)等表征的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體具有較小的粒徑，<200 nm的脂質(zhì)體可以被動(dòng)靶向至腫瘤部位[16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與游離DiR相比，DiR脂質(zhì)體可以顯著增加DiR在腫瘤部位的富集[17]。脂質(zhì)體包載后，脂質(zhì)體通過吞噬作用或內(nèi)吞作用等方式進(jìn)入細(xì)胞，且藥物被包載后具有緩釋效果，會(huì)持續(xù)釋放藥物，延長藥物作用時(shí)間，增加細(xì)胞內(nèi)的藥物水平，從而起到增強(qiáng)療效的作用[16,18]。

本研究選用人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株，其具有惡性程度高、增殖旺盛、傳代迅速、侵襲能力強(qiáng)等特點(diǎn)，適合結(jié)直腸癌體外研究，是結(jié)直腸癌體外研究常用的模式細(xì)胞[19]。本研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體可以增強(qiáng)AC對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的抗腫瘤作用。結(jié)果表明，相較于陰性對(duì)照組，AC組和ACL組均可以顯著抑制HCT116細(xì)胞的增殖及遷移，且ACL組的抑制效果更佳。這可能是AC被脂質(zhì)體包載后顯著提高細(xì)胞內(nèi)藥物水平，進(jìn)而能增強(qiáng)其對(duì)HCT116細(xì)胞增殖與遷移的抑制作用。

脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物載體，具有提高藥物被癌細(xì)胞的攝取，增加療效、降低正常組織不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。但是，脂質(zhì)體存在易被巨噬細(xì)胞清除、靶向性不高等缺點(diǎn)[20]。因此，后續(xù)研究中在脂質(zhì)體上修飾一些常用的靶向分子制備特殊性環(huán)境以進(jìn)一步增強(qiáng)ACL的抗腫瘤效果。

綜上所述，阿托伐他汀鈣脂質(zhì)體包載后顯著抑制HCT116細(xì)胞的增殖與遷移，從而增加阿托伐他汀鈣的抗結(jié)腸癌作用。