樊精敏， 白瑞斌， 王燕萍， 王子夏， 胡芳弟*

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省黨參產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程研究中心，甘肅 蘭州 730000)

低聚糖是黨參主要活性成分，具有抗氧化[1]、耐缺氧[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]等藥理作用，但它是通過粗提得到，含有大量有色雜質(zhì)而呈深棕色，嚴重影響其含量測定和活性評價。文獻[4]報道，低聚糖純化后抗氧化作用顯著提升，故本實驗對粗提黨參低聚糖進行脫色純化處理。

大孔吸附樹脂對天然產(chǎn)物中生物活性成分的脫色具有重要意義[5]，可采用靜態(tài)吸附直接過濾法同時實現(xiàn)脫色和純化目的，而且具有較高的效率[6]，但目前尚無關(guān)于黨參低聚糖純化工藝的報道。因此，本實驗采用大孔吸附樹脂對黨參低聚糖進行脫色純化，響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，同時評價該成分抗氧化活性，以期為其進一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；FA2004電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)；真空冷凍干燥機(寧波鮑斯能源裝備股份有限公司)；UV-1700紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；TS-2000A脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制備有限公司)。

黨參來源于甘肅省文縣，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院周印鎖教授鑒定為正品，按照文獻[7]報道制備低聚糖，方法為藥材粉碎后過2號篩，精密稱取5 g，加入10倍量95%乙醇，回流提取2次，每次1 h，棄去濾液，濾渣晾至無醇味，加入10倍量水煎煮3次，每次45 min，合并濾液，濃縮至原體積的1/4，緩慢加入95%乙醇至終體積分數(shù)為80%，靜置過夜后離心，10 600×g離心15 min，收集上清液，在溫度50 ℃、轉(zhuǎn)速60 r/min條件下減壓濃縮回收乙醇，蒸干，冷凍干燥至恒重，即得。

葡萄糖對照品(批號110833-201205，中國食品藥品檢定研究院)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海源葉生物科技有限公司)。DM-28、DM-21、AB-8大孔吸附樹脂[艾美科健(中國)生物醫(yī)藥有限公司]。無水乙醇(日本Sigma公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樹脂篩選 根據(jù)文獻[8]報道，本實驗選擇AB-8、DM-21、DM-28型，三者均為聚苯乙烯型非極性吸附樹脂，吸附機理為疏水性吸附，而且比表面積和孔徑較大，適合吸附中藥中的疏水性成分。

2.1.1 預(yù)處理 精密稱取3種樹脂各5 g，分別用蒸餾水、95%乙醇清洗，最后用蒸餾水洗脫殘留的乙醇。為了進一步除去其他雜質(zhì)，將樹脂依次用5%氫氧化鈉、5%鹽酸處理，最后用去離子水洗至中性。

2.1.2 脫色純化效率測定 將預(yù)處理好的3種樹脂與50 mL低聚糖溶液(10 mg/mL)一同加入150 mL錐形瓶中，振搖至吸附平衡，過濾收集液體，在溫度50 ℃、轉(zhuǎn)速60 r/min條件下減壓濃縮，蒸干，冷凍干燥至恒重，計算低聚糖脫色率、回收率，公式分別為脫色率=[(A0-A1)/A0]×100%(A0、A1分別為脫色前后低聚糖溶液在420 nm波長處的吸光度)、回收率=(C1/C0)×100%(C0、C1分別為脫色前后低聚糖含量[9])。再將脫色率、回收率權(quán)重分別設(shè)定為60%、40%，計算綜合評分，公式為綜合評分=(脫色率/脫色率最大值)×100×60%+(回收率/回收率最大值)×100×40%。

2.2 單因素試驗 按“2.1.2”項下方法處理，固定低聚糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL，體積為50 mL，考察不同脫色時間(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、樹脂用量(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 g)對低聚糖脫色純化效果的影響，各平行3份。

2.3 響應(yīng)面法 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，按“2.1.2”項下方法處理，以脫色時間(A)、pH(B)、樹脂用量(C)為影響因素，脫色率、回收率的綜合評分(Y)為評價指標，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.4 低聚糖含量測定 將經(jīng)脫色純化的低聚糖溶液冷凍干燥，采用苯酚-硫酸法測定其含量。

3 結(jié)果

3.1 樹脂篩選 如表2所示，各樹脂脫色純化效果依次為DM-28型>DM-21型>AB-8型，故選擇DM-28型作進一步研究。

表2 3種樹脂脫色純化效果比較

3.2 單因素試驗

3.2.1 脫色時間 固定pH為4，樹脂用量為2 g。如圖1所示，隨著脫色時間延長，色素分子逐漸擴散出來，低聚糖脫色率先升高后無明顯變化；脫色0.5～1 h時，由于樹脂對低聚糖的吸附逐漸增多，導(dǎo)致后者回收率急劇降低；脫色1～4 h時，低聚糖回收率先升高后逐漸降低，在2 h時綜合評分最高。因此，確定最佳脫色時間為2 h。

3.2.2 pH 固定脫色時間為2 h，樹脂用量為2 g。如圖2所示，pH 3～4時，脫色率無明顯變化，回收率逐漸升高；pH 4～7時，脫色率、回收率均逐漸降低，在pH 4時綜合評分最高。因此，確定最佳pH為4。

3.2.3 樹脂用量 固定脫色時間為2 h，pH為4。如圖3所示，隨著樹脂用量增加，吸附量逐漸大于擴散出來的色素分子，脫色率先升高后無明顯變化，回收率逐漸降低，在2 g時綜合評分最高。因此，確定最佳樹脂用量為2 g。

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 方差分析

響應(yīng)面分析見圖4。由此可知，與pH比較，脫色時間效應(yīng)面更陡，表明脫色時間對脫色純化效果的影響程度高于pH；與脫色時間比較，樹脂用量效應(yīng)面更陡，表明樹脂用量對脫色純化效果的影響程度高于脫色時間；與pH比較，樹脂用量效應(yīng)面更陡，表明樹脂用量對脫色純化效果的影響程度高于pH，結(jié)合等高線圖形狀，各因素影響程度依次為樹脂用量>脫色時間>pH。

最終確定，最優(yōu)工藝為脫色時間2.29 h，pH 4.72，樹脂用量3.18 g，根據(jù)實際情況，將其修正為脫色時間2.3 h，pH 4.7，樹脂用量3.2 g，脫色率為94.76%，回收率為88.91%，綜合評分為92.42分，與預(yù)測值92.97分接近，表明模型擬合度較好，可用于工藝優(yōu)化。

3.4 低聚糖含量測定 如圖5所示，脫色前后低聚糖含量分別為(56.60±1.51)%、(83.96±2.07)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明該成分純度顯著提高。

3.5 DPPH自由基清除實驗 如圖6所示，脫色前后低聚糖(1.25 mg/mL)對DPPH自由基的清除率分別為(59.52±2.11)%、(81.27±2.47)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明該成分DPPH自由基清除活性顯著提高。

3.6 羥自由基清除實驗 如圖7所示，脫色前后低聚糖(2.5 mg/mL)對羥自由基的清除率分別為(11.44±0.33)%、(17.94±0.30)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明該成分羥自由基清除活性顯著提高。

4 討論與結(jié)論

大多數(shù)天然來源的低聚糖含有很多色素，導(dǎo)致其顏色較深，嚴重制約定性定量、分離純化、藥理活性方面的研究[11]，故脫色是該成分制備過程中需要解決的關(guān)鍵問題。目前，常見的脫色方法有H2O2、活性炭、大孔吸附樹脂脫色等[12]，其中H2O2通過氧化色素達到脫色目的，但其較強的氧化性可能使低聚糖氧化分解加重，導(dǎo)致其損失增加[13]；活性炭粒度對脫色效果影響較大，太小時脫色后濾除困難[6]，而且它對水提得到的低聚糖脫色效果不理想[14]；大孔吸附樹脂通過選擇吸附性和篩分性去除低聚糖中色素，有很好的脫色效果[15]。

綜上所述，本實驗采用大孔吸附樹脂，通過靜態(tài)吸附直接過濾法對黨參低聚糖進行脫色純化，確定了最優(yōu)工藝，發(fā)現(xiàn)該成分純度及抗氧化活性均顯著增加，可在一定程度上改善其品質(zhì)，為后續(xù)相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。