王艷艷， 卞宏生， 李海妮， 陳芋霏， 李玟玟， 李廷利， 黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

現(xiàn)代社會越來越多的人受到睡眠障礙的困擾，經(jīng)歷著不同程度的睡眠剝奪[1]。據(jù)調(diào)查，在我國30～79歲人群中，患有睡眠障礙的高達(dá)23.1%[2]。睡眠障礙會影響重要的大腦功能，如警覺性、認(rèn)知功能，亦可增加負(fù)面情緒[3-5]。有研究表明，快速眼動睡眠剝奪可影響記憶的鞏固，導(dǎo)致海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶障礙等[6-7]。睡眠具有晝夜節(jié)律，與飲食、情緒、代謝、認(rèn)知、行為等多項生理指標(biāo)有關(guān)聯(lián)，對于維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和生理活動的正常具有重要意義[8]。

延胡索為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，具有活血化瘀、行氣止痛等功效，李時珍記載延胡索“專治一身上下諸痛，用之中的，妙不可言”。延胡索鎮(zhèn)痛的主要活性物質(zhì)為生物堿，其中以延胡索乙素作用最強(qiáng)[9-10]，鎮(zhèn)痛效果被稱為中藥中的嗎啡[11]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，延胡索乙素除具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用外，還有抗心律失常、改善血脂、保護(hù)缺血再灌注組織等作用[12-13]，并且該成分為消旋體，其左旋體活性較強(qiáng)，但它是否干預(yù)快速眼動睡眠剝奪所致的認(rèn)知障礙和睡眠活動覺醒節(jié)律尚不清楚。因此，本研究通過六角迷宮實驗和動物監(jiān)測系統(tǒng)，考察左旋延胡索乙素對快速眼動睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶功能、睡眠覺醒節(jié)律和能量代謝的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(240±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實驗室提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黑) 2018-007。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22±2)℃，相對濕度(55±15)%，12 h/12 h明暗交替。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理和使用委員會審核，實驗動物倫理審查批準(zhǔn)編號DWLL20191228001。

1.2 試劑與藥物 左旋延胡索乙素(純度≥98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號170926)；地西泮片(山東信誼制藥有限公司，批號191006)。氯化鈉注射液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號200907D06)；2% DMSO(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號D103273)；γ-氨基丁酸(GABA)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(貨號H168-1-2)、谷氨酸測試盒(貨號A074-1-1)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 睡眠剝奪箱(自制)；六角迷宮箱(俄羅斯阿穆爾國立醫(yī)學(xué)院)；實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)(型號CLAMS，美國Columbus公司)；動物行為學(xué)采集與分析系統(tǒng)(型號BL420F，成都泰盟軟件有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 32只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組及左旋延胡索乙素高、低劑量組，每組8只。左旋延胡索乙素各組分別灌胃給予15、5 mg/kg左旋延胡索乙素溶液，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，陽性藥組給予1 mg/kg地西泮溶液，每天19：00給藥1次，連續(xù)7 d。

2.2 建立睡眠剝奪模型 采用多平臺水環(huán)境法建立大鼠睡眠剝奪模型。給予藥物或生理鹽水5 d后，將動物放入睡眠剝奪箱(90 cm×70 cm×50 cm，內(nèi)有12個平臺，高8.0 cm，直徑6.3 cm，平臺之間間隔15 cm，平臺周邊注滿水，水面距平臺面約1.0 cm，水溫保持在25 ℃左右)內(nèi)進(jìn)行快速眼動睡眠剝奪，共24 h。

2.3 六角迷宮實驗 六角迷宮箱，由俄羅斯阿穆爾國立醫(yī)學(xué)院格里格力耶夫教授發(fā)明，箱體為六角形，周壁帶有6個可關(guān)閉的門，底面鋪有可通電的銅柵。訓(xùn)練時，以鈴聲為刺激，足底電擊為非條件刺激。實驗通過攝像系統(tǒng)及計算機(jī)記錄大鼠的尋找時間、尋找頻率和認(rèn)知率，綜合以上指標(biāo)，可考察動物的探究積極性、興奮性、認(rèn)知能力[14]。本實驗各組動物于給藥后第3天開始學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練，訓(xùn)練時間為3 d，于第5天進(jìn)行24 h的快速眼動睡眠剝奪，剝奪后的動物休息24 h后，于給藥第7天放入六角迷宮箱中進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶的測試，并記錄各指標(biāo)。

2.4 能量代謝、自主活動、睡眠時間和睡眠活動節(jié)律檢測 分別將睡眠剝奪后的各組大鼠置于實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)的代謝籠內(nèi)，在定時光照(照明時間為7：00～19：00，熄燈時間為19：00～次日7：00)的條件下，采用CLAMS系統(tǒng)對大鼠進(jìn)行24 h的監(jiān)測，該系統(tǒng)還持續(xù)監(jiān)測大鼠的進(jìn)食活動[15]。通過撞擊紅外光束，判斷大鼠活動次數(shù)[12](在系統(tǒng)監(jiān)測前設(shè)置參數(shù)，采集率為1 samples/60 s，即系統(tǒng)每1 min自動收集1次樣本數(shù)據(jù)，每天有1 440個采集點)，以活動次數(shù)為0作為依據(jù)，計算大鼠24 h的睡眠時間，由于19:00～20:00為灌胃給藥時間，自主活動和睡眠時間影響較大，故此時間段數(shù)據(jù)不作處理，實驗結(jié)果計算總時間為23 h(20:00～次日19:00)。

2.5 神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測 行為學(xué)實驗完成后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，頸總動脈取血，3 000 r/min離心20 min，取上清液。按試劑盒說明書操作方法進(jìn)行檢測，并計算大鼠血清中Glu和GABA水平。

3 結(jié)果

3.1 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 如表1所示，與空白組比較，模型組大鼠尋找時間、錯誤次數(shù)增加(P<0.05)，認(rèn)知率降低；與模型組比較，左旋延胡索乙素高劑量組大鼠認(rèn)知率提高，尋找時間和錯誤次數(shù)減少 (P<0.01)。

表1 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

3.2 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠自主活動的影響 如表2所示，與空白組比較，模型組大鼠白天、夜晚及全天平均活動次數(shù)均減少(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和左旋延胡索乙素各劑量組大鼠白天、夜晚及全天活動次數(shù)均減少(P<0.01)。

表2 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠自主活動的影響

3.3 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠睡眠時間的影響 如表3所示，與空白組比較，模型組大鼠白天、夜晚及全天睡眠時間均增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，陽性藥組大鼠白天、夜晚及全天睡眠時間均增加，其中夜晚睡眠時間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，左旋延胡索乙素高劑量組夜晚及全天睡眠時間增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，左旋延胡索乙素低劑量組夜晚和全天睡眠時間均增加(P<0.05，P<0.01)。

表3 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠睡眠時間的影響

3.4 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠睡眠活動節(jié)律的影響 通過降噪處理，對各組大鼠給藥后每小時的睡眠時間進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示，與空白組比較，模型大鼠在21～22時、2～3時、5～6時、15～18時睡眠時間增加(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組在22～24時、6～7時、7～8時、13～15時睡眠時間增加(P<0.05，P<0.01)，左旋延胡索乙素高劑量組在20～21時、23～24時睡眠時間增加(P<0.05，P<0.01)，16～18時睡眠時間減少(P<0.05)，左旋延胡索乙素低劑量組在22～1時、11～15時睡眠時間增加(P<0.05，P<0.01)。

3.5 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠睡眠活動節(jié)律的影響 如圖2所示，與陽性藥地西泮比較，左旋延胡索乙素作用特點為給藥后睡眠發(fā)生次數(shù)增加，睡眠時間延長，藥效發(fā)揮迅速，但其藥效維持時間相對較短，其中高劑量給藥12 h后大鼠活動力恢復(fù)。

3.6 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響 如表4所示，與空白組比較，模型組大鼠海馬中Glu和GABA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和左旋延胡索乙素高劑量組大鼠海馬中Glu和GABA水平均降低(P<0.05，P<0.01)。

表4 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

3.7 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠能量代謝的影響 如表5所示，與空白組比較，模型組大鼠白天產(chǎn)熱量、攝食量和飲水量均增加，夜晚產(chǎn)熱量和飲水量則減少；與模型組比較，陽性藥組和左旋延胡索乙素各劑量組大鼠白天攝食量減少(P<0.01)。

表5 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠能量代謝的影響

3.8 大鼠睡眠時間與能量代謝的相關(guān)性分析 如表6所示，大鼠白天睡眠時間與產(chǎn)熱量呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，夜晚睡眠時間與白天產(chǎn)熱量和攝食量均呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，上述結(jié)果提示能量代謝指標(biāo)如產(chǎn)熱量、飲水量等與睡眠時間具有一定相關(guān)性。

表6 大鼠睡眠時間與能量代謝的相關(guān)分析

4 討論

有研究顯示，正常睡眠能夠促進(jìn)記憶的鞏固，而睡眠障礙則會導(dǎo)致認(rèn)知能力下降[16]。王純等[1]發(fā)現(xiàn)慢性睡眠剝奪可加重9月齡3xTg-AD小鼠的識別記憶能力、工作記憶和條件恐懼記憶能力損傷。另有報道稱左旋延胡索乙素能抑制冰毒誘導(dǎo)的小鼠空間記憶損傷[17]。本實驗結(jié)果顯示，快速眼動睡眠剝奪后，模型組大鼠尋找時間延長，尋找頻率和認(rèn)知率降低，表明睡眠剝奪后大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙。左旋延胡索乙素干預(yù)后，高劑量組大鼠認(rèn)知率提高，錯誤次數(shù)減少，提示該成分可改善快速眼動睡眠剝奪后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

徐波等[18]采用對氯苯丙氨酸腹腔注射疊加多平臺水環(huán)境剝奪可造成大鼠睡眠節(jié)律紊亂，并考察了安寐丹對不同周期睡眠剝奪模型大鼠晝夜節(jié)律、學(xué)習(xí)記憶及食欲素的影響。本實驗結(jié)果顯示，快速眼動睡眠剝奪大鼠的睡眠時間增加，自主活動次數(shù)減少，但睡眠活動節(jié)律未改變，提示睡眠剝奪24 h未改變大鼠的晝夜節(jié)律。給藥后，陽性藥地西泮組大鼠各時間段睡眠時間均有延長，活動力降低，且維持時間長。鎮(zhèn)靜催眠藥物如地西泮等具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用，其副反應(yīng)為易產(chǎn)生依賴性、戒斷癥狀和宿醉反應(yīng)。宿醉反應(yīng)作為化學(xué)類助眠藥物的常見后遺效應(yīng)，表現(xiàn)為服藥次晨出現(xiàn)頭暈、嗜睡、精細(xì)運(yùn)動不協(xié)調(diào)等[19]。與陽性藥地西泮組比較，左旋延胡索乙素作用特點為給藥后睡眠剝奪大鼠睡眠發(fā)生次數(shù)增加，睡眠時間延長，且藥效發(fā)揮迅速，但維持時間相對較短，大鼠活動力恢復(fù)較快，無宿醉現(xiàn)象，且未呈現(xiàn)劑量依賴性。本實驗在夜晚給藥時，發(fā)現(xiàn)大鼠夜晚睡眠時間延長，前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白天給藥時，左旋延胡索乙素可增加大鼠的白天睡眠時間。因此，推測延胡索可能具有調(diào)節(jié)睡眠剝奪大鼠睡眠活動節(jié)律的作用。

清醒狀態(tài)下測得的代謝率為靜息代謝率，估算了在日常生活中大多數(shù)清醒狀態(tài)下的最低能耗。睡眠時測得的代謝率為睡眠代謝率，因為睡眠時測得的能耗值明顯減少了意識活動帶來的額外能耗部分，測得的結(jié)果具有更高重復(fù)性和精確性[20-21]。本實驗進(jìn)行了快速眼動大鼠睡眠時間與能量代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)分析。結(jié)果顯示，大鼠白天和夜晚睡眠時間與白天產(chǎn)熱量呈負(fù)相關(guān)，提示睡眠時間延長，產(chǎn)熱量減少，大鼠在睡眠狀態(tài)下意識活動減少時能耗降低。

綜上所述，左旋延胡索乙素可提高快速眼動睡眠剝奪組大鼠的認(rèn)知能力，減少自主活動，延長睡眠時間，且無宿醉現(xiàn)象，是一個極具潛力的催眠劑。然而該成分作為鎮(zhèn)靜催眠藥物的臨床應(yīng)用頻率較低，近年來實驗研究和臨床數(shù)據(jù)均較少，故本研究可為其廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。