李慧峰， 孟 霜， 王鑫鑫， 王旭艷， 孔祥鵬， 裴妙榮*

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西省現(xiàn)代中藥工程實驗室，山西 晉中 030619；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實驗室，山西 太原 030013)

良性前列腺增生是一種常見于中老年男性，多伴有進(jìn)行性尿頻、尿急、夜尿頻多、排尿困難、尿線中斷等癥狀的泌尿系統(tǒng)疾病，屬中醫(yī)學(xué)“精癃”“癃閉”范疇[1]。流行性病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[2]，隨著年齡的增長該病發(fā)病率呈遞增趨勢，其發(fā)病率50歲時約50%，80歲以后發(fā)病率接近90%。隨著我國老齡化逐漸加劇，前列腺增生發(fā)病人數(shù)逐年增多，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，給社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前針對前列腺增生的治療主要包括手術(shù)治療和化學(xué)藥物治療，手術(shù)治療后遺癥較多，如出血、尿失禁、電切綜合征、逆行射精甚至引起勃起功能障礙等，且容易復(fù)發(fā)，痛苦大，有創(chuàng)傷[3]；化學(xué)藥物治療效果并不是很理想，只能緩解局部癥狀，無法改善全身癥狀。

復(fù)方茴芹顆粒由山西省國醫(yī)大師王世民教授根據(jù)前列腺增生病因病機(jī)及臨床用藥經(jīng)驗研制而成，由羊紅膻、葛根、山楂等5味中藥組成，具有補(bǔ)腎氣、化血瘀作用，治療前列腺增生的療效顯著[4]，但其作用機(jī)制尚不明確。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對復(fù)方茴芹顆粒抑制前列腺增生的潛在靶點進(jìn)行預(yù)測，分析其可能的作用機(jī)制，并用分子對接及動物實驗給予驗證。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫24 ℃，12 h/12 h晝夜循環(huán)，空氣流通，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本研究動物實驗在山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗管理中心進(jìn)行，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號2021DW102)。

1.2 試劑與藥物 復(fù)方茴芹顆粒(批號20190506，每袋10 g，相當(dāng)于23.3 g生藥)由山西中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)大師工作室提供。非那雄胺片(批號N011372，每片5 mg)購自杭州默沙東制藥有限公司；丙酸睪丸素(批號T101368-25 g)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號15E13B46)、增強(qiáng)型RIPA裂解液(批號15G23C02)、蛋白酶抑制劑(PMSF)(批號AR1178)、5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(批號15I15B12)、洗膜緩沖液(TBST)(批號AR0031)、SDS-PAGE凝膠試劑盒(批號15G16B38)、山羊抗兔IgG二抗(批號BA1054)均購自武漢博士德生物工程有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)彩虹marker(10～180 kDa)(批號SW117)購自賽文創(chuàng)新(北京)科技有限公司；蛋白激酶B(Akt)一抗(批號ab179463)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)一抗(批號ab59348)均購自英國Abcam公司；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)一抗(批號137F5)、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)一抗(批號19H8)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)一抗(批號65373S)、表皮生長因子(EGFR)一抗(批號4267T)均購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(批號AB0037)購自北京百奧創(chuàng)新科技有限公司。

2 方法

2.1 藥物化學(xué)活性成分的篩選及活性成分靶點的獲取 通過TCMSP、TCMID及相關(guān)文獻(xiàn)獲取枸杞子、葛根、西洋參、山楂、羊紅膻等5味中藥的活性成分，TCMSP篩選活性成分的條件為生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18。通過PubChem對篩選到的活性成分進(jìn)行確認(rèn)并下載活性成分對應(yīng)的SMILES序列，將獲得的SMILES序列輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，得到活性成分的作用靶點，刪除每味藥物的重復(fù)靶點，整理得到復(fù)方茴芹顆粒的潛在靶點。

2.2 前列腺增生靶點的獲取 利用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，以前列腺增生為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)的靶點，合并2個數(shù)據(jù)庫靶點，刪除重復(fù)得到前列腺增生靶點。

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用R軟件，將得到的藥物靶點與疾病靶點映射，取交集得到復(fù)方茴芹顆粒治療前列腺增生的潛在靶點，并繪制藥物-疾病Venn圖。將得到的藥物-疾病潛在靶點導(dǎo)入STRING平臺，設(shè)置物種為“Homosapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。由于復(fù)方茴芹顆粒疾病靶點較多，利用R軟件，將PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行柱狀圖可視化。將PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，利用MCODE插件對該結(jié)果進(jìn)一步分析，得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊并對其功能進(jìn)行描述。同時通過CytoHubba3.8.2插件的MCC算法篩選Hub基因。

2.4 GO富集和KEGG通路分析 利用R軟件對復(fù)方茴芹顆粒治療前列腺增生的潛在靶點進(jìn)行GO生物過程富集和KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)通路的的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.2軟件，設(shè)定藥物-疾病靶點的degree值大于中位數(shù)的靶點來構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)通路圖。得中位數(shù)為48，最大degree值為167，因此取degree值為48～167的靶點構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)通路圖。

2.6 活性成分-靶蛋白分子對接 根據(jù)復(fù)方茴芹顆粒PPI網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，選擇degree值較大的靶蛋白Akt、EGFR，從UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)下載，保存其PDB格式文件。選擇異鼠李素、槲皮素、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷等潛在活性成分，通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載潛在活性成分的2D結(jié)構(gòu)，通過 ChemOffice 2014軟件將其能量最小化，并導(dǎo)出其3D結(jié)構(gòu)。利用分子對接Autodock vina模擬軟件，將經(jīng)過脫水分子和加氫等預(yù)處理的靶蛋白存為pdbqt格式，將化合物設(shè)置成可旋轉(zhuǎn)鍵后存為pdbqt格式，最終進(jìn)行對接模擬計算。如果結(jié)合能<0 kcal/mol表明靶蛋白和化合物可自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol表明靶蛋白和化合物結(jié)合活性較好。

2.7 動物實驗驗證

2.7.1 造模及給藥方法 參考文獻(xiàn)[5]報道建立大鼠前列腺增生模型，大鼠按照3.5 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，隨機(jī)選取58只大鼠，無菌條件下切除雙側(cè)睪丸；剩余10 只大鼠作為空白組，切開外陰皮膚但不摘除睪丸。所有大鼠恢復(fù)1周，造模后第8天，從切除雙側(cè)睪丸大鼠中挑選50只恢復(fù)狀態(tài)較好的去勢大鼠，隨機(jī)分為5組，即模型組、非那雄胺組及復(fù)方茴芹顆粒低、中、高劑量組，每組10 只。除空白組外，其余組大鼠皮下注射丙酸睪酮注射液5 mg/kg(以橄欖油為溶媒)；空白組大鼠皮下注射等量橄欖油，每天1次，連續(xù)30 d。自造模開始，復(fù)方茴芹顆粒低、中、高劑量組分別灌胃給予2.70、5.40、10.80 g/kg復(fù)方茴芹顆粒藥液，非那雄胺組灌胃給予1 mg/kg非那雄胺片，正常組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)30 d。

2.7.2 樣本采集 末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h后稱定體質(zhì)量并記錄，用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹主動脈取血，采用ELISA法檢測大鼠血清中睪酮(T)、雙氫睪酮(DHT)水平。摘取完整前列腺組織，生理鹽水清洗后，稱定腺體質(zhì)量，計算前列腺指數(shù)；取部分前列腹葉組織用10%甲醛固定，HE染色后光鏡下觀察前列腺結(jié)構(gòu)；剩余前列腺組織經(jīng)液氮速凍后移至-80 ℃冰箱保存，備用。

2.7.3 Western blot檢測目的蛋白表達(dá) 取大鼠前列腺組織，加裂解液研磨到無肉眼可見組織塊，冰上裂解30 min，BCA法檢測蛋白濃度后加蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸20 min，10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗3 次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3 次，每次10 min，使用凝膠成像系統(tǒng)顯影并拍照，通過Image J軟件對所得條帶進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方茴芹顆粒治療前列腺增生潛在靶點的獲取 通過篩選得到前列腺增生作用靶點3 733 個，復(fù)方茴芹顆粒所含羊紅膻、葛根、枸杞子等5味中藥的作用靶點548個，通過R軟件將得到的靶點映射，得到該復(fù)方治療前列腺增生的潛在靶點346個，繪制Venn圖，見圖1。

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將藥物-疾病346個靶點導(dǎo)入STRING平臺得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)信息，利用R軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)信息可視化，得到頻次排名前30的靶點見圖2。導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中，運用MCODE插件分析得到Module，并保留其中3個評分最佳的生物學(xué)進(jìn)程，見圖3。同時利用CytoHubba插件中的MCC算法分析藥物-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)中的每個節(jié)點，篩選排名前10的靶點，見圖4，顏色從紅到黃代表該靶點的重要程度遞減，依次為STAT3、VEGFA、SRC、MAPK3、MAPK1、CASP3、HRAS、MTOR、BCL2L1、EGFR。

3.3 GO富集、KEGG通路分析及疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)通路的構(gòu)建 通過R軟件進(jìn)行復(fù)方茴芹顆粒-前列腺增生潛在靶點的GO富集和KEGG通路分析。GO富集分析得到346個潛在靶點在208條GO條目上富集。前20條GO富集條目如圖5所示，涉及蛋白激酶反應(yīng)、類固醇反應(yīng)、核受體反應(yīng)等生物學(xué)過程。KEGG通路分析得到156條條目，其中包括PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、癌癥等信號通路，與前列腺增生相關(guān)性最高的前20 條通路如圖6所示。疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)通路如圖7所示。

3.4 復(fù)方茴芹顆粒核心成分與前列腺增生關(guān)鍵蛋白分子對接驗證 將網(wǎng)絡(luò)篩選的degree值較大的2個靶蛋白與藥物活性成分進(jìn)行分子對接驗證，從PDB數(shù)據(jù)庫獲得所需格式文件，靶點Akt(PDBID：1UNQ)、EGFR(PDBID：5UG9)，所有受體文件脫去水分子和加氫等預(yù)處理后，利用Autodock vina模擬軟件進(jìn)行分子對接，得到分子對接驗證結(jié)果，見表1。通過分子對接得到結(jié)合能≤-6 kcal/mol的“靶點蛋白-活性分子”12個。部分“靶點蛋白-活性分子”對接模式圖，見圖8。結(jié)果表明復(fù)方茴芹顆粒中的異鼠李素、山柰酚、槲皮素等潛在成分與關(guān)鍵靶點之間有很好的親和力，可通過作用于相關(guān)核心靶點治療改善前列腺增生。

表1 分子對接結(jié)合能結(jié)果

3.5 實驗驗證

3.5.1 復(fù)方茴芹顆粒對大鼠前列腺濕質(zhì)量和前列腺指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組大鼠前列腺濕質(zhì)量及前列腺指數(shù)均升高(P<0.01)，說明前列腺增生模型造模成功；與模型組比較，非那雄胺組及復(fù)方茴芹顆粒各劑量組大鼠前列腺濕質(zhì)量、前列腺指數(shù)均降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 復(fù)方茴芹顆粒對大鼠前列腺濕質(zhì)量和前列腺指數(shù)的影響

3.5.2 復(fù)方茴芹顆粒對大鼠血清性激素T、DHT水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清T、DHT水平均升高(P<0.01)，說明在去勢條件下，通過皮下注射丙酸睪酮注射液，使大鼠前列腺組織在外源性雄激素的作用下出現(xiàn)增生，表明大鼠前列腺增生模型成功；與模型組比較，非那雄胺組及復(fù)方茴芹顆粒各劑量組大鼠血清T、DHT水平均降低(P<0.05，P<0.01)，表明復(fù)方茴芹顆粒能抑制前列腺增生的發(fā)生，見表3。

表3 復(fù)方茴芹顆粒對大鼠血清性激素水平的影響

3.5.3 復(fù)方茴芹顆粒對大鼠前列腺組織形態(tài)的影響 空白組大鼠前列腺上皮、腺腔及間質(zhì)均正常；模型組大鼠前列腺上皮明顯增生，呈乳頭狀突向腔內(nèi)，腺體增多，腺腔明顯變形，結(jié)締組織明顯增生；復(fù)方茴芹顆粒低劑量組腺體較模型組少，乳頭狀結(jié)構(gòu)減少；復(fù)方茴芹顆粒中劑量組腺腔變大，腺體數(shù)少，小部分呈乳頭狀突向腔內(nèi)；復(fù)方茴芹顆粒高劑量組前列腺上皮、腺腔、間質(zhì)基本恢復(fù)正常，極少部分呈乳頭狀突入腔內(nèi)，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與非那雄胺組接近；非那雄胺組腺腔明顯減少，偶有上皮細(xì)胞增生所致的乳頭狀皺褶突入腺腔，見圖9。

3.5.4 復(fù)方茴芹顆粒對大鼠前列腺組織關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織PI3K、Akt、Bcl-2、VEGFA、EGFR、ERK1/2蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，非那雄胺組及復(fù)方茴芹顆粒各劑量組PI3K、Akt、Bcl-2、VEGFA、EGFR、ERK1/2蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)，見表4、圖10。

表4 復(fù)方茴芹顆粒對大鼠前列腺組織關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

4 討論

前列腺增生是中老年男性常見病、多發(fā)病，隨著老年化進(jìn)程的加快，其發(fā)病率逐年升高[6]，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。中藥復(fù)方是我國中醫(yī)整體觀、辨證論治在用藥上的體現(xiàn)，具有多成分、多靶點、多途徑、作用機(jī)制復(fù)雜的特點[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用節(jié)點和連接，從整體角度揭示了中藥復(fù)方“藥物-基因-靶點-疾病”之間復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以此預(yù)測藥物可能的作用機(jī)制，科學(xué)地解釋中藥復(fù)方的藥理機(jī)制及配伍關(guān)系[8]。本研究通過對復(fù)方茴芹顆粒5味藥材分析得到槲皮素、異鼠李素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷等藥物活性成分。槲皮素、異鼠李素均為黃酮類化合物，可延緩或抑制前列腺增生發(fā)展進(jìn)程。施建豐等[9]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素通過調(diào)節(jié)p-STAT改變BMDM的極性從而調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)。

經(jīng)篩選得到與復(fù)方茴芹顆粒活性成分有較高結(jié)合活性的核心基因，在抑制前列腺增生中發(fā)揮主要作用，包括Akt、VEGFA、MAPK3、SRC、EGFR等。VEGFA是具有高度血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增強(qiáng)血管通透性，促使新生血管的生成[10-11]。有研究表明，前列腺增生患者體內(nèi)VEGF水平升高，但機(jī)制尚不明確[12]。MAPK是一種重要的蛋白激酶，在細(xì)胞生長、分化、凋亡過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[13]，ERK是其亞型之一，主要參與促進(jìn)有絲分裂。EGFR與表皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子等配體結(jié)合后，形成二聚體與ATP結(jié)合而自身磷酸化，激活下游信號通路，調(diào)節(jié)前列腺細(xì)胞的增殖、凋亡以及血管生成[14]。

分析發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt、HIF-1、MAPK等信號通路可能是復(fù)方茴芹顆粒治療前列腺增生的主要途徑。Bcl-2能夠抑制細(xì)胞的凋亡，在前列腺增生患者中高表達(dá)[15-16]。有研究表明，阻斷PI3K-Akt信號通路可以抑制前列腺增生[17]，PTEN抑癌基因可使PIP3去磷酸化而減弱來自PI3K的激活信號，間接抑制Akt的功能[18]，Akt蛋白表達(dá)降低，使其底物Bad蛋白磷酸化水平降低，Bad與Bcl-2形成復(fù)合體，使Bcl-2蛋白表達(dá)降低而表現(xiàn)促前列腺細(xì)胞凋亡的活性，抑制前列腺增生。研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在前列腺增生患者中高表達(dá)，可抑制前列腺增生[19-20]，未活化的Akt能降低HIF-1α及其轉(zhuǎn)錄靶基因VEGF的表達(dá)。VEGF介導(dǎo)的血管生成作用可能是SRC依賴[21]，抑制EGFR酪氨酸磷酸化，從而抑制MAPK級聯(lián)反應(yīng)[22]，使前列腺增生基質(zhì)細(xì)胞ERK表達(dá)降低，抑制前列腺上皮細(xì)胞增長。

研究還將復(fù)方茴芹顆粒有效核心成分與關(guān)鍵靶基因進(jìn)行了分子對接驗證，證明了配體與受體均具有良好的親和力。對PI3K-Akt、MAPK等信號通路的關(guān)鍵靶點進(jìn)行Western blot驗證，結(jié)果顯示復(fù)方茴芹顆粒通過下調(diào)PI3K-Akt、MAPK等信號通路，抑制前列腺增生的發(fā)生發(fā)展。本研究為復(fù)方茴芹顆粒的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步實驗研究。