馬 躍， 孔 涵， 張善云， 刁娟娟

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011)

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)是一種以IgA沉積為主的系統(tǒng)性小血管炎[1]。學(xué)齡前期及學(xué)齡期兒童最為多見，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]，可引起腹痛、紫癜、關(guān)節(jié)痛等，且部分患者伴有腎損傷等癥狀，甚至可以發(fā)展為腎功能不全。過敏性紫癜的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與體液免疫紊亂、T細(xì)胞亞群功能失調(diào)、凝血與纖溶機(jī)制紊亂等有關(guān)[3]。臨床上多應(yīng)用抗感染、抗過敏、抗血小板聚集等的綜合療法。對于存在嚴(yán)重腹痛、關(guān)節(jié)痛等癥狀，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物，但非選擇性抑制作用導(dǎo)致對免疫系統(tǒng)與代謝產(chǎn)生改變，導(dǎo)致白內(nèi)障、高血壓和體重增加等，同時只能用于緩解癥狀，不能降低腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)，停藥后復(fù)發(fā)率較高[4]。因此，需要明確過敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制，探索可能的靶點(diǎn)和靶向治療藥物，對于制定更有效的診斷和治療策略至關(guān)重要。

1 方法

1.1 檢索疾病靶點(diǎn) 在NCBI數(shù)據(jù)庫中，以“Henoch-Schonlein purpura”為關(guān)鍵詞，并且限定物種為“Homo sapiens”，檢索出與過敏性紫癜相關(guān)的基因。

1.2 篩選KEGG通路 DAVID是一個在線生物學(xué)知識庫，為研究人員提供一套全面的功能注釋工具[5]。將檢索出的過敏性紫癜疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，限定獲得過敏性紫癜相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG信號通路。為了使結(jié)果具有高度可靠性，因此篩選出P<0.01的疾病通路。

1.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò) STRING是一個用于探索和分析蛋白質(zhì)之間相互作用在線工具[6]。統(tǒng)計(jì)富集在每條通路上的過敏性紫癜的靶點(diǎn)，篩選出富集在P<0.01通路上的非冗余靶點(diǎn)和出現(xiàn)頻次高(頻率>10)的靶點(diǎn)，同時在CTD數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證非冗余靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)性。非冗余靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫，篩選出度值較高的高度值非冗余靶點(diǎn)。

1.4 核心靶點(diǎn)篩選 將篩選出的高度值非冗余靶點(diǎn)與高頻靶點(diǎn)取交集，作為過敏性紫癜的重要靶點(diǎn)。再將重要靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫獲取高度值的核心靶點(diǎn)。

1.5 篩選中藥和中醫(yī)癥狀 將核心靶點(diǎn)依次輸入Symmap數(shù)據(jù)庫查找每個核心靶點(diǎn)所對應(yīng)的P<0.05的Herb和TCM symptom相關(guān)條目，導(dǎo)出、篩選并分析高頻次的中藥、中藥分類以及中醫(yī)癥狀。

1.6 核心靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路分析 將核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路分析，獲得GO功能的生物過程(BP)，細(xì)胞組分(CC)，分子功能(MF)以及相關(guān)KEGG信號通路。

2 結(jié)果

2.1 篩選靶點(diǎn)基因 在NCBI數(shù)據(jù)庫中共篩選出75個過敏性紫癜靶點(diǎn)。

2.2 篩選KEGG通路 獲得過敏性紫癜相關(guān)靶點(diǎn)P<0.05的KEGG通路54個，P<0.01的KEGG信號通路40個，見圖1。

2.2.1 細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體交互作用 細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體交互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction，CCI)網(wǎng)絡(luò)是機(jī)體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成，在改善機(jī)體炎性反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫功能中有重要作用[7]。CCI主要富集表現(xiàn)在趨化因子和TNF家族中，通過趨化因子信號梯度，在過敏性紫癜的病理過程中起重要作用。CXC趨化因子配體16(CXCL16)主要在抗原提呈細(xì)胞表面表達(dá)，可以通過受體特異性結(jié)合激活T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞進(jìn)而提高T細(xì)胞的增殖、遷徙及浸潤，促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)[8-9]。同時INF、TNF等炎癥細(xì)胞因子也可以進(jìn)一步促使CXCL16的表達(dá)水平上調(diào)，調(diào)控炎癥水平。通過觀察過敏性紫癜患者血清、尿液中CXCL16，發(fā)現(xiàn)CXCL16可以作為早期診斷過敏性紫癜的敏感指標(biāo)，且CXCL16水平與尿蛋白定量呈正相關(guān)性，也可作為預(yù)測紫癜性腎炎病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一[10]。

2.2.2 T細(xì)胞受體信號通路 T細(xì)胞受體信號通路在形成T細(xì)胞功能和免疫突觸中起到關(guān)鍵作用，在抵抗感染的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。T細(xì)胞受體激活CD4+T細(xì)胞，分化為Th1、Th2和Th17細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞。通過研究過敏性紫癜患者外周血T細(xì)胞亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子等的變化，發(fā)現(xiàn)過敏性紫癜患者存在Th1/Th2失衡，大量合成、分泌IgA，出現(xiàn)異常免疫應(yīng)答引起免疫損傷[12]。通過T細(xì)胞受體通路調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖，能夠改善過敏性紫癜的細(xì)胞及體液免疫紊亂[13]。霉酚酸酯可能通過調(diào)控T-bet/GATA3表達(dá)，恢復(fù)過敏性紫癜小鼠Th1/Th2平衡，控制并改善過敏性紫癜的癥狀[14]。Th1/Th2、Th17/Treg的平衡在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。因此，在過敏性紫癜病理過程中，細(xì)胞因子失衡對機(jī)體造成的潛在損傷不容忽視，應(yīng)當(dāng)在治療中密切監(jiān)測。

2.2.3 Toll樣受體信號通路 TLR2、TLR4是TLRs家族的兩個主要成員，與相應(yīng)的配體接觸后，通過信號傳導(dǎo)促進(jìn)IL6、IL8、IL10等，引起中性粒細(xì)胞趨化聚集，使毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致炎癥損傷，促進(jìn)免疫功能紊亂，與過敏性紫癜的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。此外TLR通過多種機(jī)制參與Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡，對維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。通過調(diào)控Toll樣受體信號通路，提高TLR2蛋白表達(dá)率，能夠改善細(xì)胞免疫功能[16]。因此以TLR為靶點(diǎn)治療過敏性紫癜可能是一種新的治療策略。

2.2.4 NF-κB信號通路 TNF-α可以通過激活NF-κB，抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的釋放，活化的NF-κB誘導(dǎo)TNF-α等促炎因子的產(chǎn)生[17]。NF-κB影響下游氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過上調(diào)MMP-3、MMP-9的表達(dá)，可降解血管系膜使得內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強(qiáng)，造成血管內(nèi)皮屏障損傷，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生[18]。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將40條通路整理歸類并統(tǒng)計(jì)后獲得44個非冗余靶點(diǎn)、高度值非冗余靶點(diǎn)18個、高頻靶點(diǎn)10個。同時在CTD數(shù)據(jù)庫對非冗余靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證并繪制熱圖，相關(guān)性分?jǐn)?shù)越高代表該靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)性越好(見圖2)。非冗余靶點(diǎn)和高頻靶點(diǎn)蛋白互作圖見圖3～4，其中度值越大，顏色越深且圖標(biāo)越大。

2.4 核心靶點(diǎn)篩選 過敏性紫癜核心靶點(diǎn)10個，分別為IL10、IL6、TNF、CXCL8、TLR4、TLR2、IL18、IL1B、IFNG、CD40LG，利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖5)。

2.5 篩選中藥和中醫(yī)癥狀 含有大于7項(xiàng)的中藥共70味，20種中藥分類主要有清熱解毒藥、活血祛瘀藥、清熱燥濕藥、清熱瀉火藥、補(bǔ)益藥(陽、氣、陰)、祛風(fēng)濕散寒藥、理氣藥等，中藥主要有金銀花、連翹、黃芪、板藍(lán)根、小薊等，同時獲得P<0.05的高頻詞中醫(yī)癥狀28個，主要有斑疹、關(guān)節(jié)痛、腹痛、頭痛等(圖6～7)。

2.6 GO功能和KEGG通路分析 通過GO分析，過敏性紫癜的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及其對細(xì)胞因子的正調(diào)控、MyD88依賴的Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，中性粒細(xì)胞的趨化性，T細(xì)胞增殖的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程等生物過程(圖8)。通過KEGG通路分析，這些重要靶點(diǎn)在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路等信號通路中發(fā)揮重要作用(圖9)。

4 討論

中醫(yī)診療方案將過敏性紫癜分為風(fēng)熱傷絡(luò)、血熱妄行、濕熱痹阻、陰虛火旺、氣不攝血、氣滯血瘀，以“濕、熱、瘀”為主的辨證思路，治療以祛濕清熱、涼血化瘀為主。通過對重要靶點(diǎn)基因預(yù)測的中藥及其歸類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)以清熱解毒藥、活血祛瘀藥頻數(shù)最高，如金銀花、連翹、黃芪等。金銀花、連翹具有廣譜抗菌、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛及抑制毛細(xì)血管通透性的作用[19]。由金銀花、連翹組成的銀翹散，為風(fēng)熱傷絡(luò)的主方。對過敏性紫癜采用營衛(wèi)論治、三焦辯證共同選方銀翹散加減為治衛(wèi)氣分證與上焦證，臨床療效佳[20-21]。近年來血瘀理論的提出在過敏性紫癜的診療進(jìn)程中尤為重要，以小薊為主要藥物的經(jīng)典方劑小薊飲子，為血熱妄行證的首選方劑。許華教授[22]自擬消癜湯加減，其中小薊、牡丹皮等具有活血化瘀藥物的使用，更體現(xiàn)了“熱毒”致瘀、從瘀論治過敏性紫癜的觀點(diǎn)。黃芪具有抗氧自由基作用，保護(hù)腎小球基膜屏障、改善血管微循環(huán)[23]。補(bǔ)中益氣湯、歸脾湯、黃芪顆粒、玉屏風(fēng)散可以健脾益氣補(bǔ)血，有效調(diào)節(jié)患兒免疫功能，有效降低過敏性紫癜復(fù)發(fā)率[24-26]。過敏性紫癜當(dāng)分為兩期論治，正虛階段多見于陰虛火旺、氣陰兩虛，常應(yīng)用補(bǔ)益藥類似黃芪、桑寄生、女貞子等，邪實(shí)階段宜用疏風(fēng)、清熱、涼血等治法，常選用金銀花、連翹、赤芍等清熱涼血之品[27]。過敏性紫癜以斑疹(紫黑、色淡)、關(guān)節(jié)疼痛(刺痛、腫痛、鈍痛)、腹痛(綿綿、冷痛)、發(fā)熱(烘熱、低熱、身熱)、五心煩熱、頭痛等為主要表現(xiàn)，對應(yīng)病機(jī)體現(xiàn)血瘀、氣滯、氣陰不足等。中醫(yī)以辨證論治為基礎(chǔ)，臨床選方上具有靈活性，多成分，多靶點(diǎn)，多通路發(fā)揮作用。

免疫炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激在過敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[28]。早期清除急性期的炎癥介質(zhì)可能有助于緩解腎臟損害并改善過敏性紫癜的臨床癥狀。IL6的表達(dá)水平與過敏性紫癜的發(fā)生有相關(guān)性，并且與腎臟受累的嚴(yán)重程度直接相關(guān)[29]。通過血流灌注可有效減少IL6、TNF-α等，改善腎臟損害與病情發(fā)展[30]。過敏性紫癜患兒本身存在T細(xì)胞功能紊亂，Th17過度活化，Treg生成減少，IL6等過度表達(dá)破壞Th17/Treg平衡[31]。B10細(xì)胞與過敏性紫癜的發(fā)生和嚴(yán)重程度有關(guān)，CD40-CD40L信號通路可誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IL10，刺激調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的產(chǎn)生[32]。在TWEAK的刺激下產(chǎn)生促炎作用，導(dǎo)致血管周圍白細(xì)胞浸潤與內(nèi)皮損傷[33]。阻斷TWEAK能抑制炎癥浸潤減少趨化因子的產(chǎn)生，這可能為過敏性紫癜治療提供新的治療策略。達(dá)培酮通過抑制IL-8的釋放與趨化作用，破壞IgA和IgG的合成，起到抗氧化劑清除劑、抗炎作用，可作為過敏性紫癜的替代療法[34]。免疫復(fù)合物激活相關(guān)信號通路抑制IL6、IL10、TNF等細(xì)胞因子的釋放及免疫應(yīng)答。

本研究對過敏性紫癜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步確定過敏性紫癜發(fā)病中的關(guān)鍵靶點(diǎn)和途徑，為過敏性紫癜的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。