黃梓煒，吳雪輝，周悅，藍(lán)小河，張兵

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642)

肉桂精油是從桂皮、桂枝、桂葉等部位提取的油狀液體[1]，其中含有肉桂醛、肉桂醇、桂皮酸等多種重要的活性成分[2]，這些活性物質(zhì)具有抑菌活性和抗氧化活性[3-4]，使得肉桂精油對(duì)多種微生物具有良好的抑菌效果[5-6]。王芳等[7]發(fā)現(xiàn)肉桂精油能改變細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌有明顯的抑菌作用。Zhang等[8]用肉桂精油作抑菌劑，發(fā)現(xiàn)其對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子活力和真菌萌發(fā)均有明顯的抑制作用。

可食性復(fù)合膜是指可食性大分子物質(zhì)與食品添加劑、表面活性劑等經(jīng)過加工后得到的具有選擇透過性的薄膜[9-10]，繼續(xù)添加天然抗菌植物精油，使之變成具有抗菌作用的復(fù)合膜[11]，復(fù)合膜能夠有效地將植物精油包埋在膜內(nèi)，控制精油的釋放，保留植物精油的抗菌活性[12]。鄭玉璽等[13]在可食性復(fù)合膜中添加荔枝木質(zhì)精油后，抑菌活性大大增強(qiáng)，能夠有效地抑制革蘭氏菌的生長(zhǎng)。逯文倩等[14]研究表明牛至精油復(fù)合膜可以明顯控制雙孢蘑菇病原菌數(shù)量的增長(zhǎng)，從而減少雙孢蘑菇因感染細(xì)菌導(dǎo)致的腐爛現(xiàn)象。隨著復(fù)合膜的發(fā)展應(yīng)用，不同精油與復(fù)合膜的混合效果成為了研究重點(diǎn)，本試驗(yàn)以肉桂精油復(fù)合膜為研究對(duì)象，測(cè)定肉桂精油復(fù)合膜的細(xì)菌與酵母菌抑制性能，旨在為復(fù)合膜的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

肉桂精油：廣州百花香料股份有限公司；吐溫80、甘油、瓊脂粉、酵母提取物、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、無水葡萄糖、氯化鈉：均為分析純。

1.1.2 供試菌種

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

HWS-24恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器 金壇市城東新瑞儀器廠；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 姜堰市銀河儀器廠；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；HWS-80智能恒溫恒濕箱 上海比朗儀器制造有限公司；BTS-100R恒溫?fù)u床 上海精其儀器有限公司；SJ-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；GI36DWS自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器 致微(廈門)儀器有限公司；LBI-300-L生化培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肉桂精油復(fù)合膜的制備

以蒸餾水體積為基準(zhǔn)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%的氧化羥丙基木薯淀粉溶液，在70 ℃下加熱攪拌30 min，使淀粉糊化，冷卻至室溫后，以淀粉溶液體積為基準(zhǔn)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的甘油和1.0%的吐溫80，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的肉桂精油，將物料混勻后傾倒于平板玻璃皿中，靜置10 min后烘干、揭膜，復(fù)合膜于50%的相對(duì)濕度和25 ℃的溫度條件下平衡48 h，備用。

1.2.2 菌種活化與菌懸液的制備

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種到LB培養(yǎng)基中于37 ℃下培養(yǎng)24 h；將釀酒酵母接種到PDA培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行一次活化；用移液管移取1 mL已活化一次的菌液采用相同條件進(jìn)行二次活化，之后保存于低溫環(huán)境中。

1.2.3 肉桂精油對(duì)細(xì)菌和酵母菌抑菌效果的測(cè)定

制作含菌平板，在每個(gè)含菌平板中央放置1個(gè)已滅菌的直徑為6 mm的牛津杯，并向其中滴加10 μL肉桂精油，于對(duì)照組加入10 μL無菌水，測(cè)量抑菌圈直徑，用雙倍稀釋法測(cè)定肉桂精油的MIC與MBC，再根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，判定敏感程度[15-16](抑菌圈直徑大于20 mm為極敏感，15～20 mm為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，6～10 mm為低度敏感，抑菌圈直徑小于6 mm為不敏感)。

1.2.4 肉桂精油復(fù)合膜對(duì)細(xì)菌和酵母菌抑菌效果的測(cè)定

向平板中加入100 μL菌懸液，均勻涂布后靜置5 min。將復(fù)合膜樣品裁剪成直徑為20 mm的圓形膜片，紫外滅菌20 min，用無菌鑷子將樣品膜放置于含菌平板中心，靜置5 min后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，運(yùn)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油對(duì)供試菌抑菌效果的分析

肉桂精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母的抑菌效果見圖1～圖3。

圖1 肉桂精油對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小Fig.1 Inhibition zone size of cinnamon essential oil against Escherichia coli

圖2 肉桂精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小Fig.2 Inhibition zone size of cinnamon essential oil against Staphylococcus aureus

圖3 肉桂精油對(duì)釀酒酵母的抑菌圈大小

由圖1～圖3可知，對(duì)照組a中均未表現(xiàn)出抑菌活性，而在添加了肉桂精油后，3種供試菌平板中出現(xiàn)了不同直徑的抑菌圈，金黃色葡萄球菌平板中的抑菌圈直徑為(34.28±0.58) mm，大腸桿菌平板中的抑菌圈直徑為(26.38±0.51) mm，根據(jù)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，肉桂精油對(duì)兩種細(xì)菌均表現(xiàn)為極敏感，能夠得出肉桂精油的細(xì)菌抑制性強(qiáng)，且對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌作用優(yōu)于革蘭氏陰性菌。此試驗(yàn)結(jié)果與李娜等[17]、Khazaei等[18]研究中肉桂精油對(duì)革蘭氏菌的抑菌結(jié)果一致，這是因?yàn)槿夤鹁图捌涫杷越M分可直接作用于磷脂雙分子層，阻止酶和蛋白的結(jié)合，從而提高了細(xì)胞膜的通透性，并引起細(xì)胞膜破裂，膜內(nèi)物外滲，所以起到了抑菌效果[19]。此外，釀酒酵母平板中的抑菌圈直徑為(48.07±0.84) mm，也表現(xiàn)為極敏感，表明肉桂精油對(duì)酵母菌的抑菌活性優(yōu)于細(xì)菌，在劉笑宇[20]的研究中也得出肉桂精油對(duì)酵母菌的抑制作用優(yōu)于細(xì)菌的結(jié)論。

肉桂精油對(duì)3種供試菌的MIC值和MBC值結(jié)果見表1和表2。

表1 肉桂精油對(duì)供試菌的MIC值Table 1 MIC values of cinnamon essential oil against tested bacteria

表2 肉桂精油對(duì)供試菌的MBC值Table 2 MBC values of cinnamon essential oil against tested bacteria

由表1和表2可知，肉桂精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC值均為0.25 μL/mL，MBC值分別為1，4 μL/mL，兩種細(xì)菌的MBC值明顯大于其MIC值，但釀酒酵母的MIC值和MBC值卻相同，且相較于兩種供試細(xì)菌更低，皆為0.125 μL/mL，表明肉桂精油對(duì)酵母菌的抑菌效果更明顯。

2.2 肉桂精油復(fù)合膜的細(xì)菌抑制活性分析

2.2.1 復(fù)合膜的大腸桿菌抑菌效果分析

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉桂精油復(fù)合膜對(duì)革蘭氏陰性的大腸桿菌的抑菌效果見圖4。

由圖4可知，對(duì)照組a中未添加肉桂精油，平板內(nèi)長(zhǎng)滿了大腸桿菌，而在添加了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)肉桂精油的試驗(yàn)組中出現(xiàn)了大小不同的抑菌圈，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的肉桂精油復(fù)合膜的抑菌圈直徑分別為(15.26±0.77)，(26.44±0.57)，(34.07±0.40)，(41.61±0.85)，(48.98±0.38) mm，根據(jù)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，除了0.5%的肉桂精油復(fù)合膜對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)為高度敏感外，其余均表現(xiàn)為極敏感。

圖4 復(fù)合膜對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小Fig.4 Inhibition zone size of composite film against Escherichia coli

2.2.2 復(fù)合膜的金黃色葡萄球菌抑菌效果分析

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉桂精油復(fù)合膜對(duì)革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌的抑菌效果見圖5。

圖5 復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小Fig.5 Inhibition zone size of composite film against Staphylococcus aureus

由圖5可知，對(duì)照組a中未出現(xiàn)抑菌活性，而當(dāng)復(fù)合膜中肉桂精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.5%增加至1.0%時(shí)，抑菌圈直徑由(21.55±0.52) mm增大至(29.37±0.43) mm；肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、2.0%時(shí)，抑菌圈直徑增大為(38.44±0.44)，(44.76±0.97) mm；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，抑菌圈直徑增大為(54.43±0.74) mm，在藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)下，肉桂精油復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)為極敏感。

對(duì)比分析圖4與圖5，在相同肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，復(fù)合膜對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制作用優(yōu)于革蘭氏陰性菌，這是因?yàn)楦锾m氏陽性菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中僅有單一的肽聚糖層結(jié)構(gòu)，而革蘭氏陰性菌是雙層的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，且具有外膜蛋白或細(xì)胞壁脂多糖的保護(hù)，使得革蘭氏陰性菌能夠防止多種物質(zhì)的滲入與透過，所以革蘭氏陰性菌對(duì)肉桂精油復(fù)合膜的耐受程度優(yōu)于革蘭氏陽性菌，抑菌圈更小。

2.3 肉桂精油復(fù)合膜的酵母菌抑菌作用分析

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉桂精油復(fù)合膜對(duì)釀酒酵母的抑菌效果見圖6。

圖6 復(fù)合膜對(duì)釀酒酵母的抑菌圈大小Fig.6 Inhibition zone size of composite film against Saccharomyces cerevisiae

由圖6可知，對(duì)照組a中無抑菌圈生成，不存在抑菌活性，而當(dāng)肉桂精油的添加量為0.5%時(shí)平板中的抑菌圈直徑為(30.52±0.71) mm；肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、1.5%時(shí)抑菌圈直徑增大至(38.43±0.86)，(47.62±0.88) mm；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)抑菌圈直徑增大至(66.77±1.13) mm，直至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，抑菌圈直徑擴(kuò)大至與平板直徑相同，此時(shí)的抑菌效果達(dá)到最強(qiáng)。根據(jù)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，肉桂精油復(fù)合膜對(duì)釀酒酵母均表現(xiàn)為極敏感，且將試驗(yàn)結(jié)果與細(xì)菌的抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果相比較可以得出，在相同的肉桂精油添加量下，復(fù)合膜對(duì)酵母菌的抑菌活性優(yōu)于細(xì)菌。

3 結(jié)論

肉桂精油對(duì)3種供試菌具有良好的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母的抑菌圈直徑分別為26.38，34.28，48.07 mm，MIC分別為0.25，0.25，0.125 μL/mL，MBC分別為1，4，0.125 μL/mL。肉桂精油復(fù)合膜對(duì)3種供試菌的抑菌活性強(qiáng)弱順序與肉桂精油相同，均為釀酒酵母>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌，且隨著肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，復(fù)合膜抑菌作用增強(qiáng)。當(dāng)肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.5%增加至2.5%時(shí)，大腸桿菌的抑菌圈直徑由15.26 mm增大到48.98 mm，金黃色葡萄球菌從21.55 mm增大到54.43 mm，釀酒酵母則由30.52 mm擴(kuò)大到平板上沒有菌生長(zhǎng)，得出肉桂精油復(fù)合膜能夠有效保留肉桂精油的抑菌活性并且有效地抑制微生物的生長(zhǎng)，為復(fù)合膜的應(yīng)用提供了參考。