王麗媛，周寧，寧月寶*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭市腫瘤醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

姜在我國歷史悠久，種植面積廣泛，是食品的主要調(diào)味料之一[1]。姜在日常食品和藥物方面都有廣泛的應(yīng)用，是一種非常具有研究價值的植物[2]。生姜中的主要活性成分是姜辣素[3]。姜辣素是姜中所有辣味成分的總稱，姜辣素中的主要活性成分有很多，含量最高的是姜酚[4]。姜酚有極高的藥用價值，在降血脂、抗氧化、抗腫瘤和抗炎等方面都具有非常顯著的效果[5-11]。超臨界CO2萃取法可以在接近室溫下進行萃取，這樣可以有效防止熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散。因此，這種方法可以將高沸點、低揮發(fā)性、易熱解的物質(zhì)在遠低于其沸點的溫度下萃取出來，既可獲得揮發(fā)性成分，又可獲得非揮發(fā)性成分[12-14]。

姜辣素在食品、藥品、保健品等方面具有很大的應(yīng)用前景，但目前對于姜辣素功能發(fā)揮機制的研究還停留在初級階段，還需進一步探究姜辣素的作用機制。本實驗通過對糖尿病大鼠灌胃從黑姜中提取出的姜辣素，觀察大鼠血糖值變化，并對從中提取出的姜辣素進行成分分析，以此為理論依據(jù)對降血糖藥物的研發(fā)具有很大的意義，為姜辣素將來在人類疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物及材料

SD大鼠(40只，體重180～220 g，雄性)：購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心；新鮮生姜：購自包頭市昆都侖區(qū)友誼菜市場。

1.2 藥品及主要試劑

四氧嘧啶：購自Sigma公司；生理鹽水：購自吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司；無水乙醇、香草醛、正丁醇：購自天津永大化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器

DPMCLJ10超臨界(CO2)流體裝置 德帕姆(杭州)泵業(yè)科技有限公司；DFT-200 200 g手提式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；SHB循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；JA5003分析天平、FA5003電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；UV-7504紫外可見分光光度計 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；601超級恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；751玻璃比色皿 宜興市晶科光學(xué)儀器有限公司；血糖儀、GA-3血糖試條 三諾生物傳感股份有限公司；BPS-100CL恒溫恒濕箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 黑姜的發(fā)酵

將處理好的生姜放入恒溫恒濕箱內(nèi)按照規(guī)定的條件溫度(68.0±1.0) ℃、濕度(95.0±1.0)%進行自然發(fā)酵，在多種菌的作用下，發(fā)生美拉德反應(yīng)，發(fā)酵30 d即可得到黑姜發(fā)酵品[15-16]。發(fā)酵后的黑姜營養(yǎng)成分顯著升高，辛辣氣味減少，是一種天然健康的保健食品[17]。將發(fā)酵好的黑姜放入烘干箱中進行烘干，烘干后粉碎，過60目篩備用。

2.2 黑姜姜辣素的提取

采用超臨界CO2萃取的方法提取黑姜姜辣素，萃取條件為溫度47 ℃、頻率25 Hz、壓力30 MPa，萃取2 h。在萃取過程中要時刻注意壓力變化，使壓力在所要求的壓力附近，越接近越好，這樣產(chǎn)生的誤差越小，也能使提取的姜辣素更能達到實驗要求。將提取得到的黑姜姜辣素置于棕色樣品瓶中，在4 ℃條件下儲存。

2.3 黑姜姜辣素含量的測定

2.3.1 香草醛標準溶液的配制

用天平準確稱取0.05 g香草醛，用95%乙醇溶解并定容至100 mL，取4.0 mL稀釋好的液體于第2個容量瓶中，再次稀釋至100 mL，得到濃度為20 μg/mL的香草醛標準指示劑[18]。

2.3.2 標準曲線的繪制

準確吸取香草醛標準溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，得到濃度為2，4，6，8，10，12 μg/mL的標準溶液樣品，以95%乙醇作空白，在280 nm波長處用1 cm比色皿測定吸光度A。

通過吸光度值繪圖計算香草醛回歸方程，回歸方程中的R2越接近1，回歸方程越準確。得到線性方程y=0.0267x+0.1774，R2=0.9993(見圖1)。

圖1 香草醛標準曲線Fig.1 Vanillin standard curve

2.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測條件

色譜條件：流動相氦氣作為載氣，色譜柱柱前壓60.4 kPa，分流比10∶1，升溫程序：色譜柱的初始柱溫80 ℃，保持時間3 min，然后以20 ℃/min的升溫速率升溫至140 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min的升溫速率升溫至230 ℃，保持3 min，最后以15 ℃/min的升溫速率升溫至260 ℃，保持5 min，汽化室溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，色譜柱為Rtx-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.15 μm)。

質(zhì)譜條件：電子的電離電源為EI源，電子轟擊能量70 eV，電子倍增管電壓0.8 kV，質(zhì)量掃描范圍15～400 m/z，時間間隔1 s。

2.5 高血糖大鼠模型的建立

2.5.1 動物模型

將大鼠隨機分組，選取對照組10只、模型組10只、實驗組20只，對模型組和實驗組一次性腹腔注射2%的四氧嘧啶溶液，建立糖尿病大鼠模型[19]。注射前禁食不禁水12 h后，避光環(huán)境下注射200 mg/kg四氧嘧啶，對照組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水作為空白對照。實驗組大鼠根據(jù)血糖值的不同分為中高血糖組與高血糖組。對照組、實驗組每日灌胃200 mg/kg黑姜姜辣素溶液，持續(xù)4周，記錄灌胃期間大鼠的血糖濃度變化。

2.5.2 血糖測定

在對實驗組、模型組和對照組大鼠注射等量的四氧嘧啶溶液及生理鹽水72 h后，將大鼠禁食不禁水12 h，在尾部采血，使用血糖儀測定其血糖濃度，當血糖濃度大于7.0 mmol/L時即為建模成功。

3 實驗結(jié)果

3.1 黑姜姜辣素含量

用超臨界萃取法提取黑姜中姜辣素，萃取得到的姜辣素使用香草醛比色法測定得到濃度。準確吸取樣品供試液4.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即為測定樣品。多次測量吸光度，結(jié)果見表1。

表1 黑姜姜辣素含量表Table 1 Content of gingerol in black ginger

代入香草醛回歸方程求出相應(yīng)濃度C，按下式計算黑姜姜辣素含量：

式中:2.001為香草醛換算姜辣素的系數(shù)；C為測定的 A值在回歸方程中求出的香草醛濃度，μg/mL；V1為測定的樣品溶液總體積，mL；V0為樣品提取液總體積，mL；V2為測定時吸取的樣品供試液體積，mL；W為樣品重，g；106為將微克數(shù)換算成克數(shù)。

3.2 高血糖大鼠模型的建立結(jié)果

在對大鼠注射四氧嘧啶溶液后，將建模成功的大鼠再次分組，模型組10只、黑姜姜辣素灌胃組20只。其中黑姜姜辣素灌胃組又根據(jù)其血糖濃度水平進行分組，將血糖濃度在7～15 mmol/L定為中高血糖組，血糖濃度大于15 mmol/L定為高血糖組。實驗組、模型組以及對照組一同作為黑姜姜辣素降血糖作用的研究對象。

3.3 黑姜姜辣素灌胃結(jié)果

將建模成功的大鼠進行分組后，對大鼠進行每天1次、連續(xù)28 d的灌胃，每隔1周測其血糖值，對比灌胃前血糖值的平均值，得到灌胃前后平均血糖濃度變化，見表2。

表2 大鼠血糖濃度變化Table 2 Changes of blood glucose concentration of rats

對實驗組、模型組以及對照組灌胃前后血糖濃度值用SPSS 19.0軟件分析后，得出中高血糖組、高血糖組的P<0.01，對照組、模型組的P>0.05，說明黑姜姜辣素可以顯著降低實驗組大鼠血糖濃度，而對照組大鼠的血糖濃度幾乎沒有變化，模型組大鼠的血糖濃度不但沒有下降反而上升了12.97%。

3.4 黑姜姜辣素檢測結(jié)果

發(fā)酵黑姜姜辣素中化學(xué)成分的GC-MS總離子流圖見圖2。

圖2 黑姜姜辣素中化學(xué)成分的總離子流圖Fig.2 Total ion curent diagram of chemical components in black ginger gingerol

使用專業(yè)分析軟件(SHIMADZU GCMSsolution Release 2.10)對總離子流進行分析，分析結(jié)果得到100多種化合物?；衔锔鹘M中的相對峰按照面積歸一法計算百分比含量[20]。根據(jù)所得到的質(zhì)譜信息可鑒定成分，使用譜庫檢索數(shù)據(jù)實行檢索。通過與標準圖譜相對比，進行化學(xué)結(jié)構(gòu)的確認。表3中列出的各物質(zhì)峰面積在0.10以上，檢測出經(jīng)發(fā)酵后的黑姜中姜辣素的主要成分6-姜酚占總含量的7.21%，姜酮占總含量的4.32%。

為了方便觀察，現(xiàn)將提取得到的黑姜姜辣素化學(xué)成分中主要的幾種物質(zhì)進行總結(jié)，結(jié)果見表3。

表3 黑姜姜辣素中部分化學(xué)成分鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of some chemical components in black ginger gingerol

4 討論與結(jié)論

本實驗采用超臨界萃取法提取黑姜中的姜辣素成分，萃取條件為溫度47 ℃、頻率25 Hz、壓力30 MPa，萃取2 h，最后黑姜姜辣素的含量為2.05%。通過對大鼠腹腔注射2%的四氧嘧啶溶液建立糖尿病大鼠模型，而通過四氧嘧啶建模的大鼠血糖數(shù)值相對穩(wěn)定。將成功建模的大鼠分為模型組、中高血糖組和高血糖組糖尿病大鼠模型。在對模型組自由給水，實驗組、對照組灌胃相同量的姜辣素溶液一段時間后，通過對比灌胃前后大鼠血糖濃度變化，發(fā)現(xiàn)高血糖組大鼠血糖濃度下降51.9%，中高血糖組大鼠血糖濃度下降69.31%，而對照組的大鼠血糖濃度下降2.35%，其血糖濃度下降并不顯著。模型組大鼠血糖值不但沒有下降，反而上升了12.97%。綜上可以得出黑姜姜辣素對糖尿病大鼠具有顯著的降血糖作用，而對正常大鼠幾乎沒有作用。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對提取得到的黑姜姜辣素進行檢測后，共檢出100多種物質(zhì)，而姜辣素的主要成分6-姜酚占總含量的7.21%，姜酮占總含量的4.32%，研究姜辣素的成分對于降血糖藥物的研發(fā)具有深遠意義。