許繼業(yè)，牟志剛，劉國華，郁萬文

（1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.日照市公用事業(yè)管理服務(wù)中心，山東日照 276827；3.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 句容 212400）

實生育苗繁殖方法簡便，易于操作，種子來源廣，便于規(guī)模化繁殖，用這種方法繁殖出的實生苗具有根系發(fā)達、主根強大、入土較深、植株健壯、抗逆性強、壽命長等特點。所以生產(chǎn)中，銀杏Gingko biloba葉用園多采用直接播種實生育苗方法。較多研究結(jié)果表明，從家系水平選育葉用銀杏優(yōu)良種質(zhì)是可行的。張云躍等[1]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉中類黃酮和萜內(nèi)酯含量在產(chǎn)區(qū)間、產(chǎn)區(qū)內(nèi)、家系間、家系內(nèi)以及單株間均有廣泛的遺傳差異；于國棟等[2]提出，在培育以藥用為主的葉用銀杏人工原料林時，應(yīng)采用“產(chǎn)地-家系-單株”的聯(lián)合選育模式進行良種選育；肖新華等[3]也認為銀杏葉用良種的最佳選擇途徑為種源、家系聯(lián)合選擇。在葉用銀杏園的經(jīng)營過程中，在栽培環(huán)節(jié)注重的是銀杏葉產(chǎn)量，在加工利用環(huán)節(jié)注重的是銀杏葉品質(zhì)。與國外相比，我國葉用銀杏的栽培存在起步晚、葉質(zhì)量不穩(wěn)定等問題[4]。因此，亟待開展高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葉用銀杏家系資源研究，選育并推廣有效成分含量高且穩(wěn)定的家系。本研究中以38 個銀杏半同胞家系為材料，測定銀杏葉主要功能性狀和功能組分（類黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇）的含量，探究銀杏葉主要功能性狀和功能組分含量在家系間的差異，篩選葉功能性狀和功能組分含量兼優(yōu)的葉用家系，旨在為葉用銀杏種植提供優(yōu)良的播種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試銀杏家系的母樹為邳州市銀杏種質(zhì)資源圃的38 個銀杏優(yōu)良無性系，母樹基本信息見表1。2019年9月，從38 個銀杏無性系母樹上采集種實，經(jīng)脫皮調(diào)制后通過低溫層積沙藏完成生理后熟。2020年3月中旬，經(jīng)催芽后，播種于口徑10 cm、高30 cm 的營養(yǎng)缽中，每個營養(yǎng)缽1 粒，每家系播種100 粒。播種后，進行澆水、除草等常規(guī)管理。2020年9月15日，每家系隨機采集4 個單株的全株葉片，按單株存放，進行表型指標測定。隨機采集另外4 個單株的全株葉片，按單株存放，于105 ℃殺青15 min，60 ℃烘干至恒定質(zhì)量，粉碎過40 目篩，即得功能性組分含量待測材料。

表1 參試銀杏家系母樹的采集地Table 1 The collection site of mother tree of each G.biloba family for study

1.2 指標測定

1.2.1 葉表型指標

使用EPSON 掃描儀將葉片掃描成圖片；利用Photoshopc cs6 軟件的直方圖功能計算葉面積；使用1/1 000 電子天平測定其干質(zhì)量，重復(fù)3 次。以葉干質(zhì)量除以其葉面積得到比葉干質(zhì)量。

1.2.2 總黃酮含量

總黃酮的提取及測定方法參照文獻[5]，略有改動。色譜條件：色譜柱為Supersil ODS2（4.6 mm×150 mm，3 μm），流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（56∶44），柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長360 nm。采用外標法對樣本定量，黃酮組分標準曲線見表2。計算總黃酮含量（ωf）：

表2 銀杏類黃酮標準品的標準曲線方程?Table 2 Standard curve equation of three G.biloba flavonoid component standards

ωf=2.51×(ωq+ωc+ωi)。

式中：ωq為槲皮素質(zhì)量分數(shù)，ωc為山柰酚質(zhì)量分數(shù)，ωi為異鼠李素質(zhì)量分數(shù)。

1.2.3 萜內(nèi)酯含量

萜內(nèi)酯的提取及測定參照張渝陽等[6]的方法，略有改動。以銀杏內(nèi)酯A 標準品繪制標準曲線，以銀杏內(nèi)酯A 的濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，采用最小二乘法擬合標準曲線，得到曲線方程y=2.4834x+0.061，r=0.999。計算萜內(nèi)酯含量（ωt）：

ωt=xt×n×V1/(V×W)。

式中：xt為利用曲線方程換算出的銀杏內(nèi)酯A 的濃度，n為稀釋程度，V1為樣品溶液總體積，V為參試樣品體積，W為樣品質(zhì)量。

1.2.4 聚戊烯醇含量

聚戊烯醇的提取及測定參照王成章[7]和楊克迪等[8]的方法，略有改動。以聚戊烯醇標準品繪制標準曲線，以聚戊烯醇的濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，采用最小二乘法擬合曲線，得到曲線方程y=0.457 1x+0.325 5，r=0.998。計算聚戊烯醇含量（ωp）：

ωp=xp×n×V1/(V×W)。

式中：xp為利用曲線方程換算出的聚戊烯醇濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)匯總，使用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析、Duncan 多重比較、Pearson 相關(guān)性分析，使用Origin 2020 軟件進行主成分分析和聚類分析。采用隸屬函數(shù)法對各銀杏半同胞家系的葉用價值進行綜合評價。

主成分分析：

式中：Ci為第i個綜合指標得分，Yj為第i個主成分載荷矩陣表中初始因子j的載荷矩陣，λi為第i個主成分相對應(yīng)的特征值，Xj′是第j個原始指標值經(jīng)過標準化處理后的值。

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：Xj為第j個指標的值，Xmin為第j個綜合指標的最小值，Xmax為第j個綜合指標的最大值，μ(Xj)是第j個指標的隸屬函數(shù)值。

式中：wj為第j個綜合指標的權(quán)重，pj為第j個綜合指標的貢獻率。

式中：D為綜合評價值。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏半同胞家系間葉功能性狀的差異

參試銀杏家系單葉干質(zhì)量、單葉面積和比葉干質(zhì)量見表3。方差分析和多重比較結(jié)果顯示，單葉干質(zhì)量、單葉面積和比葉干質(zhì)量在各銀杏家系間均呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。各家系單葉干質(zhì)量為51.0 ～120.2 mg，變異系數(shù)為21.7%，其中單葉干質(zhì)量最大的是16 號，為最小值（70 號）的2.36 倍，單葉干質(zhì)量高于均值（83.179 mg）的家系共有17 個。各家系單葉面積為12.617 ～28.854 cm2，變異系數(shù)為19.0%，其中單葉面積最大的是16 號，為最小值（20 號）的2.29 倍，單葉面積高于均值（19.919 cm2）的家系共有17 個。各家系比葉干質(zhì)量為3.532 ～4.776 mg/cm2，變異系數(shù)為7.5%，其中比葉干質(zhì)量最大的是18 號，為最小值（70 號）的1.35 倍，比葉干質(zhì)量高于均值（4.150 mg/cm2）的家系共有17 個。單葉干質(zhì)量、單葉面積在銀杏家系間的變異系數(shù)均大于10%，說明這2 個指標在家系間存在廣泛變異，這為篩選大葉銀杏家系提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

表3 參試銀杏家系葉功能性狀?Table 3 The main functional traits of 38 G.biloba families

2.2 銀杏半同胞家系間葉功能性組分含量的差異

參試銀杏家系葉片總黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇含量見表4。方差分析和多重比較結(jié)果顯示，總黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇含量在銀杏家系間存在極顯著差異（P＜0.01）。各銀杏家系葉片的總黃酮質(zhì)量分數(shù)為11.244 ～26.595 mg/g，變異系數(shù)為20.2%，其中總黃酮質(zhì)量分數(shù)最高的是18 號，為最小值（39 號）的2.37 倍，總黃酮質(zhì)量分數(shù)高于均值（15.629 mg/g）的家系共有17 個。各銀杏家系葉片的萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)為4.060 ～6.778 mg/g，變異系數(shù)為11.1%，其中萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)最高的是65 號，為最小值（23 號）的1.67 倍，萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)高于均值（5.302 mg/g）的家系共有17 個。各銀杏家系葉片的聚戊烯醇質(zhì)量分數(shù)為7.654 ～36.848 mg/g，變異系數(shù)為36.3%，其中聚戊烯醇質(zhì)量分數(shù)最高的是68 號，為最小值（21 號）的4.81 倍，聚戊烯醇質(zhì)量分數(shù)高于均值（19.376 mg/g）的家系共有14 個。葉片的總黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇含量在銀杏家系間的變異系數(shù)均大于10%，說明銀杏葉中3 個主要功能組分含量在家系間存在豐富的變異，這為篩選高品質(zhì)的葉用銀杏家系提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

表4 參試銀杏家系葉功能組分的質(zhì)量分數(shù)?Table 4 The contents of main functional components of 38 G.biloba families mg/g

2.3 銀杏家系葉功能性狀及組分含量的相關(guān)性

銀杏家系葉功能性狀及組分含量的相關(guān)系數(shù)見表5。由表5可知：葉主要功能性狀中的單葉干質(zhì)量與單葉面積、比葉干質(zhì)量均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；單葉面積與比葉干質(zhì)量呈現(xiàn)弱度正相關(guān)，未達到顯著水平（P＞0.05）。葉主要功能成分總黃酮質(zhì)量分數(shù)、萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)以及聚戊烯醇質(zhì)量分數(shù)兩兩間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）?？傸S酮質(zhì)量分數(shù)與單葉干質(zhì)量、單葉面積呈現(xiàn)弱度負相關(guān)，與比葉干質(zhì)量呈現(xiàn)正相關(guān)，均未達到顯著水平（P＞0.05）；萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)與單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；聚戊烯醇質(zhì)量分數(shù)與單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量均呈現(xiàn)弱度負相關(guān)，均未達到顯著水平（P＞0.05）。

表5 參試銀杏家系葉功能性狀及組分含量的相關(guān)系數(shù)?Table 5 Correlation of leaf functional traits and component contents of 38 G.biloba families

2.4 銀杏家系葉功能性狀與組分含量的綜合評價

參試銀杏家系各指標的主成分分析結(jié)果見表6。經(jīng)過主成分分析，將6 個單項指標轉(zhuǎn)換成綜合指標，根據(jù)累計貢獻率大于80%的原則篩選出前3個綜合指標，貢獻率分別為43.333%、22.146%、16.173%，累計貢獻率為81.625%。由表6可知，在第1 主成分中，單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量、萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)的載荷較大且均為正向載荷，主要反映了葉功能性狀和萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)；在第2主成分中，總黃酮的載荷最大，反映了總黃酮質(zhì)量分數(shù)；在第3 主成分中，聚戊烯醇質(zhì)量分數(shù)的載荷較大，反映了聚戊烯醇質(zhì)量分數(shù)。

表6 參試銀杏家系各葉用指標的主成分分析結(jié)果Table 6 Principal component analysis results of individual leaf- using indexes of 38 G.biloba families

參試銀杏家系葉用價值的綜合評價值見表7，各家系的綜合評價值越大，表明其葉用價值越高，反之越低。銀杏家系根據(jù)綜合評價值由大到小排序依次為18、65、54、30、27、36、16、28、37、39、51、34、9、21、31、43、44、42、14、47、52、67、57、19、46、61、29、59、20、68、25、63、13、23、48、40、60、70。

表7 參試銀杏家系葉用價值的綜合評價值和排名?Table 7 Comprehensive evaluation value and ranking of leaf use value of 38 G.biloba families

2.5 基于葉用價值的銀杏家系聚類

以前3 個主成分得分值與權(quán)重的乘積為指標，采用“歐式距離-類平均法”對38 個參試銀杏家系進行聚類，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，當歐式距離為0.65 時，可將38 個家系分為5 個類群。各類家系葉用指標的平均值見表8。第Ⅰ類僅包括18 號家系，此類家系的比葉干質(zhì)量、總黃酮含量、萜內(nèi)酯含量最高，單葉干質(zhì)量、單葉面積中等偏上，聚戊烯醇含量最低；第Ⅱ類包括68 號家系，此類家系的聚戊烯醇含量最高，其余各指標處于中等偏下水平；第Ⅲ類包括20、23、40、48、60、70號家系，此類家系單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量、萜內(nèi)酯含量均為最低，總黃酮含量處于中等、聚戊烯醇含量中等偏上；第Ⅳ類包括16、30、34、36、39、54、65 號家系，此類家系的單葉干質(zhì)量和單葉面積最大，比葉干質(zhì)量、萜內(nèi)酯含量中等偏上，聚戊烯醇含量處于中等，總黃酮含量最低；第Ⅴ類為剩余所有家系（23 個），此類家系的總黃酮含量中等偏上、聚戊烯醇含量中等偏下，其余指標均中等水平。

圖1 基于葉用價值的參試銀杏家系聚類結(jié)果Fig.1 Clustering results of G.biloba families based on leaf value

表8 各類銀杏家系葉用指標的平均值Table 8 Average value of leaf use index in various G.biloba families

根據(jù)主成分分析和聚類分析結(jié)果，篩選出較優(yōu)的8 個家系（16、18、30、34、36、39、54、65 號），這些家系的單葉干質(zhì)量和單葉面積最大，比葉干質(zhì)量、萜內(nèi)酯含量中等偏上，其中18 號家系的比葉干質(zhì)量、葉片總黃酮和萜內(nèi)酯含量均最高?？筛鶕?jù)生產(chǎn)實踐，進一步區(qū)劃試驗或定向推廣這8 個葉用優(yōu)良家系。值得注意的是，68 號家系具有最高的聚戊烯醇含量，可作為高聚戊烯醇特異家系進行定性培育。

3 結(jié)論與討論

不同銀杏半同胞家系間葉片主要功能性狀（單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量）和主要功能組分（總黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇）含量均存在極顯著差異，呈現(xiàn)出較高的遺傳變異，變異系數(shù)為7.5%～36.3%，為葉用銀杏家系篩選提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。葉片主要功能性狀中的單葉干質(zhì)量與單葉面積、比葉干質(zhì)量均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)；葉主要功能組分總黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇的質(zhì)量分數(shù)間均無顯著相關(guān)性；主要功能組分中僅萜內(nèi)酯含量與單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)?；? 個綜合指標，聯(lián)合應(yīng)用隸屬函數(shù)綜合評價和聚類分析，篩選出較優(yōu)的8個家系（16、18、30、34、36、39、54、65 號），這些家系的單葉干質(zhì)量和單葉面積最大，比葉干質(zhì)量、萜內(nèi)酯含量中等偏上，其中18 號家系的比葉干質(zhì)量、葉片總黃酮和萜內(nèi)酯含量均最高?？筛鶕?jù)生產(chǎn)實踐，進一步區(qū)劃試驗或定向推廣這8個家系。另外，68 號家系具有最高的聚戊烯醇含量，可作為高聚戊烯醇特異家系進行定性培育。

植物遺傳變異是良種選育的基礎(chǔ)，植物個體差異受基因和環(huán)境因子共同影響，分布在不同氣候地區(qū)的同種植物往往會發(fā)生較大變異，并通過種子保存下來[9]。大量研究結(jié)果表明，銀杏不同種源、居群、家系、單株的葉中功能性組分的含量均具有顯著差異[3-4,10-14]。郁萬文等[4]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，54 個供試銀杏無性系間黃酮、萜內(nèi)酯含量存在遺傳變異；Zhou 等[13]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，10 個地理居群銀杏葉功能組分含量存在極顯著差異。本研究結(jié)果表明，38 個銀杏半同胞家系間葉片功能性狀及功能組分含量均存在極顯著差異（P＜0.01），其中變異系數(shù)超過10%的葉功能性狀有單葉干質(zhì)量、單葉面積，其含量的變異系數(shù)超過10%的葉功能組分有總黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇，表現(xiàn)出較高的變異性和遺傳多樣性。本研究中栽培條件一致，故基因是造成差異的主要因素，這為葉用銀杏優(yōu)良種質(zhì)篩選提供了可能性。

本研究結(jié)果表明，3 個功能組分中僅萜內(nèi)酯含量與單葉干質(zhì)量、單葉面積、比葉干質(zhì)量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，說明可以通過單葉干質(zhì)量、單葉面積及比葉干質(zhì)量等葉功能性狀來預(yù)測葉片萜內(nèi)酯含量，或基于葉片萜內(nèi)酯含量進行特異種質(zhì)資源的初選。葉片的總黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇含量間均無顯著相關(guān)性，說明不能從供試的家系中選育出總黃酮、萜內(nèi)酯和聚戊烯醇含量兩者較高或三者均較高的家系。進一步說明不能從供試的家系中選育出葉功能指標較好、多功能組分含量較高的家系，所以有必要對供試家系進行綜合評價，從中選育出2 類指標均較優(yōu)的家系。

迄今，已有大量有關(guān)造林樹種家系的篩選與評價的研究報道。樊民亮[15]在研究馬尾松子代變異及優(yōu)良親本選擇時設(shè)定不同入選率，入選家系遺傳增益隨著入選率的降低而升高。謝樂[16]以10%的入選率選擇厚莢優(yōu)良材用半同胞子代；闕青敏[17]認為不同選擇水平的選擇增益不同，通過多層次的綜合選擇，能獲得較大的增益。覃敏[18]在選育材用米老排時，以育種值為評價依據(jù)，按25%的入選率選擇優(yōu)良家系。欒柯權(quán)[19]采用“布雷金”多性狀綜合評定法對水曲柳半同胞家系進行綜合評價，并以10%的入選率選擇優(yōu)良材用家系。李光友等[20]按適生型家系7/51 的入選率，計算出供試雜交桉在家系、單株水平的遺傳增益值；按優(yōu)于對照無性系得分值15/51 的入選率，計算出供試雜交桉在家系、單株水平的遺傳增益值。然而，上述研究中的優(yōu)良家系入選率均是人為界定的，缺少理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。聚類分析常被用在種質(zhì)資源評價中，可以綜合多項指標對植物進行綜合評價和分類。在界定類群時，應(yīng)兼顧入選率和遺傳增益，使入選率不能過高或過低，同時具有較高的遺傳增益，一般以3 ～6 類為宜。但是聚類分析中賦予各指標的權(quán)重均相等，忽視了不同指標的貢獻率，通過主成分分析則可以對新產(chǎn)生的綜合指標進行權(quán)重賦值。因此，本研究中在確定葉功能性狀和功能組分含量的目標性狀基礎(chǔ)上，基于3 個綜合指標，聯(lián)合應(yīng)用隸屬函數(shù)綜合評價和聚類分析，篩選出較優(yōu)的8 個家系，單葉干質(zhì)量和單葉面積最大，比葉干質(zhì)量、萜內(nèi)酯含量中等偏上。其中，18 號家系的比葉干質(zhì)量、葉片總黃酮和萜內(nèi)酯含量均最高。

銀杏葉產(chǎn)量及葉中功能組分含量會隨著苗齡的增加而變化，本研究中僅探討了1年生家系銀杏葉功能性狀和功能組分含量的差異，且未涉及家系內(nèi)單株間的差異。為了篩選出葉大、功能組分含量高的家系及家系內(nèi)單株間葉功能性狀及功能組分含量差異小的家系，有必要對這些銀杏家系，尤其是初選出的8 個家系進行連年定位研究，并進行家系內(nèi)單株間銀杏葉功能性狀及功能組分含量的穩(wěn)定性或差異性研究。