荊鑫，張強(qiáng)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

1 吉西他濱與脫氧胞苷激酶的作用過(guò)程

吉西他濱(2'，2' - 雙氟脫氧胞苷，GEM)是細(xì)胞周期特異性的DNA合成、修復(fù)抑制劑，屬于胞嘧啶核苷衍生物，也屬于代謝物抗癌藥，其抗癌作用通過(guò)細(xì)胞的吸收及磷酸化。它主要作用于脫氧核糖核酸合成階段的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞從g1向S的發(fā)展，限制D脫氧核糖核酸復(fù)制和細(xì)胞分裂。吉西他濱轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制脫氧核糖核酸復(fù)制作用需要借助腫瘤細(xì)胞膜的多種人核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(hNTs)，這些人核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括鈉依賴型(hCNT)和鈉非依賴型(hENT)。吉西他濱作為臨床一線化療用藥，長(zhǎng)期在胰腺癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的臨床治療中發(fā)揮作用[6]。

在細(xì)胞中，吉西他濱依賴于脫氧胞苷激酶(dCK)的作用才能發(fā)揮癌作用的發(fā)揮，這是一種重要的代謝調(diào)節(jié)因子，可催化很多種特定底物水平磷酸化。它作為脫氧胞苷激酶磷酸化反應(yīng)的良好底物，經(jīng)脫氧胞苷激酶磷酸化后，吉西他濱主要生成了三種磷酸化下游產(chǎn)物。作為DNA復(fù)制過(guò)程中的重要原料，脫氧核苷酸需要通過(guò)核苷酸還原酶還原而產(chǎn)生，然而核苷酸還原酶的活性可以被吉西他濱二磷酸鹽抑制，從而使脫氧核苷酸的產(chǎn)生減少，進(jìn)一步負(fù)反饋抑制作用被逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致更多的吉西他濱三磷酸鹽的積聚。同時(shí)三磷酸鹽可以直接抑制脫氧胞苷脫氨酶，進(jìn)而使更多的單磷酸鹽轉(zhuǎn)化成活性代謝產(chǎn)物二磷酸鹽和三磷酸鹽，這些活性產(chǎn)物又通過(guò)上述方式來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，進(jìn)而發(fā)揮它們的抗癌作用[7]，除此之外，活性產(chǎn)物三磷酸鹽也可利用自身特有的“掩蔽鏈”作用，達(dá)到干擾腫瘤細(xì)胞DNA自我修復(fù)的目的，進(jìn)而阻礙腫瘤細(xì)胞的DNA合成，DNA鏈斷裂，最終殺死腫瘤細(xì)胞[8]。有研究證明癌癥患者體內(nèi)如果脫氧胞苷激酶表達(dá)量下降、活性降低甚至于基因缺失則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核苷酸庫(kù)失去平衡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，會(huì)降低核苷類藥物的抗癌效用[9]。因此，脫氧胞苷激酶被認(rèn)為是吉西他濱和其他核苷藥物體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，對(duì)此類藥物發(fā)揮抗癌效用起著十分關(guān)鍵的作用。

2 基因的遺傳多態(tài)性與吉西他濱及其他核苷類藥物化療耐藥性的相關(guān)性研究

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指因?yàn)榛蚪M水平上單核苷酸變異而造成的DNA鏈斷裂，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。序列多態(tài)性屬于人類最常見(jiàn)的遺傳和變異類型之一。由于它可以影響基因的表達(dá)及其對(duì)應(yīng)蛋白的合成，所以SNP在影響人體對(duì)藥物的代謝反應(yīng)中的作用越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的重視。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)核苷類抗腫瘤藥物代謝關(guān)鍵酶(dCK)的多個(gè)相關(guān)SNP位點(diǎn)可影響其基因的表達(dá)及其對(duì)應(yīng)蛋白的合成，從而影響該類藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的復(fù)制和生長(zhǎng)的抑制作用，削弱其抗癌療效。所以某些SNP位點(diǎn)有可能用來(lái)預(yù)測(cè)核苷類藥物效用。

對(duì)于脫氧胞苷激酶(dCK)來(lái)說(shuō)，其SNP可以位于非編碼區(qū)或編碼區(qū)，可以各自影響其基因表達(dá)以及對(duì)應(yīng)蛋白的合成和活性，最終影響該代謝關(guān)鍵酶的效用。近年來(lái)，隨著臨床對(duì)藥物代謝過(guò)程和基因組學(xué)不斷深入的研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到藥物代謝酶的單核苷酸多態(tài)性可能是個(gè)體出現(xiàn)作用差異的主要因素，愈來(lái)愈多的證據(jù)表明抗腫瘤藥物代謝關(guān)鍵酶dCK基因的遺傳多態(tài)性是使癌癥患者在化療過(guò)程中敏感程度不同的原因之一，有報(bào)道稱與核苷類藥物代謝有關(guān)的酶的SNP的改變可引起藥代動(dòng)力學(xué)和毒性之間的個(gè)體差異[10]。因此，尋找影響吉西他濱等化療藥物基因表達(dá)或蛋白質(zhì)合成及活性的關(guān)鍵SNP位點(diǎn)，相當(dāng)于尋找這些化療藥物的化學(xué)敏感性遺傳標(biāo)記。在臨床上對(duì)患者實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)化療藥物敏感性的目的，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥患者的個(gè)體化治療，顯著提高患者預(yù)后。

脫氧胞苷激酶(DCK)包含7個(gè)外顯子，該基因在人類第4號(hào)染色體上，其相對(duì)分子質(zhì)量為34kb，它主要通過(guò)磷酸化脫氧胞苷及其類似物來(lái)在癌癥治療中發(fā)揮的抵抗作用。有研究發(fā)現(xiàn)在在急性髓細(xì)胞性白血病(AML)的化療中所采取的1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(AraC)的細(xì)胞毒活性受dCK磷酸化代謝的影響，從而影響其化療效果[11]。目前，許多研究表明多個(gè)dCK基因的SNP位點(diǎn)與核苷類化療敏感性有關(guān)。通過(guò)檢測(cè)dCK基因的SNP位點(diǎn)可以預(yù)測(cè)化療的敏感性。

自發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性在核苷類藥物化療中的重要影響以來(lái)，有越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)研究者在這一領(lǐng)域想要探索出更明確的方向，2004年，陳竺等人的研究小組對(duì)不同種族的人群進(jìn)行了dCK基因測(cè)序，鑒定出十三種之前沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，最終確認(rèn)了7種，這7個(gè)SNP位點(diǎn)就是關(guān)于影響dCK基因或蛋白活性改變的SNP位點(diǎn)。在122項(xiàng)針對(duì)急性白血病患者的dCK基因研究中，Mank-Seymour發(fā)現(xiàn)C-360G和C-201T這兩個(gè)SNP位點(diǎn)的基因遺傳頻率較高。同時(shí)擁有基因型-360CG/-201TT患者對(duì)核苷類藥物的敏感性高于基因型-360CG或基因型-201TT的患者，前者dCK基因轉(zhuǎn)錄水平較高，因此兩個(gè)SNP位點(diǎn)-360CG/-201 TT與核苷類藥物反應(yīng)相關(guān)。證實(shí)了SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性在核苷類藥物化療中重要作用[12]；2007年，Lamba等人在人類DNA樣本中研究了他們的歐洲和非洲祖先的dCK基因，發(fā)現(xiàn)這些樣本中dCK基因的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域存在C356G和C364T SNP突變，而這些SNP位點(diǎn)的突變與dCK的活性降低有關(guān)。此外，Lamba J等人還發(fā)現(xiàn)了dCK基因的表達(dá)在非洲人群中相較北歐和其他后裔人群更高更廣泛[13]。Joerger等人[14]發(fā)現(xiàn)了dCK基因的C364 T SNP突變位點(diǎn)與dCK的酶活性的降低和dCK相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降有緊密聯(lián)系；2008年Kocabas[15]等通過(guò)對(duì)人的240個(gè)DNA樣本重測(cè)序來(lái)研究dCK和CMPK基因的遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了dCK基因中A70G和C364T兩個(gè)SNP位點(diǎn)的突變與dCK的蛋白表達(dá)和dCK酶活性的降低密切相關(guān)，因此為通過(guò)檢測(cè)SNP位點(diǎn)預(yù)測(cè)胰腺癌患者核苷類藥物化療療效給予了方向；Rivero[16]針對(duì)74例正在使用吉西他濱化療方案的濾泡性淋巴瘤患者進(jìn)行dCK基因的多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了那些C28624T SNP位點(diǎn)發(fā)生改變的癌癥患者在化療后出現(xiàn)了不同的副作用，提示可以利用檢測(cè)dCK基因SNP位點(diǎn)的突變來(lái)預(yù)測(cè)胰腺癌患者吉西他濱化療的預(yù)后情況。Okazaki等人[17]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以在化療期間對(duì)吉西他濱產(chǎn)生抗性，其中機(jī)制之一是決定吉西他濱在細(xì)胞內(nèi)的吸收的核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—人平衡核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(hENT-1)表達(dá)水平的降低引起的，可以引起dCK基因A727C SNP突變位點(diǎn)，從而影響胰腺癌患者的化療療效；因此，我們的研究和分析表明，吉西他濱的化療敏感性與腫瘤組織中dCK的表達(dá)密切相關(guān)。其中，dCK高表達(dá)的患者采用以吉西他濱為主的化療方案治療時(shí)可以有更好的效果。

此外，研究人員還針對(duì)臨床上接受吉西他濱化療的胰腺癌患者，采取了他們接受吉西他濱化療前的腫瘤組織樣本和他們接受化療后的腫瘤組織樣本的生存時(shí)間做了相關(guān)性分析，結(jié)果表明腫瘤組織中dCK蛋白的含量與患者的化療后生存期關(guān)系緊密，dCK蛋白表達(dá)水平越高，生存時(shí)間越長(zhǎng)[18]。以上這些研究發(fā)現(xiàn)都為利用檢測(cè)dCK基因SNP位點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)胰腺癌患者吉西他濱化療敏感性提供了依據(jù)。

3 脫氧胞苷激酶(dCK)蛋白表達(dá)與吉西他濱化療敏感性的關(guān)系

脫氧胞苷激酶(dCK)廣泛存在于人體組織和細(xì)胞中，屬于一種代謝酶，它可以使人體的核苷酸庫(kù)保持平衡，并催化多種特異性底物的磷酸化，如嘧啶和嘌呤脫氧核苷，包括重要的抗病毒藥物和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制藥物等。吉西他濱就是dCK磷酸化的良好底物之一，吉西他濱通過(guò)細(xì)胞膜上的人核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞，繼而被dCK分步磷酸化，而其產(chǎn)生的磷酸化產(chǎn)物，可以通過(guò)許多種方式來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞中DNA的復(fù)制及合成，化療藥物就達(dá)到了它的抗腫瘤作用。吉西他濱在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤效用的過(guò)程中脫氧胞苷激酶在其中起到了不可或缺的作用，扮演了化療藥物活化過(guò)程中限速酶的角色[19]。

介于dCK在核苷類藥物的抗腫瘤效用中扮演了不可或缺的作用，那么我們當(dāng)然可以猜想dCK活性的改變會(huì)直接影響到這一類化療藥物的化療效果。Hubeek等人[20]利用了118個(gè)兒科組織樣本(包括多種癌癥)研究脫氧胞苷激酶蛋白的表達(dá)水平，這些樣本包括病理切片和組織細(xì)胞等成分等，發(fā)現(xiàn)不同癌癥患者脫氧胞苷激酶蛋白的表達(dá)情況不相同，除此之外他們還發(fā)現(xiàn)患有同一種癌癥病人的脫氧胞苷激酶蛋白的表達(dá)水平也存在個(gè)體性差異，進(jìn)一步證實(shí)了臨床癌癥患者體內(nèi)脫氧胞苷激酶蛋白的表達(dá)水平與阿糖胞苷等化療類藥物的敏感性相關(guān)。

綜上已經(jīng)可以看出目前醫(yī)學(xué)界對(duì)癌癥患者體內(nèi)dCK基因及其編碼蛋白的表達(dá)與核苷類藥物的化療療效的相關(guān)性的初步探索已經(jīng)有很多，期望通過(guò)發(fā)現(xiàn)他們之間的相關(guān)性來(lái)實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)胰腺癌患者接受吉西他濱化療療效的目的。Kroep等[21]建立了包括胰腺癌、肺癌、膀胱癌等七種小鼠的腫瘤模型，并開(kāi)展了吉西他濱化療敏感性的檢測(cè)，也測(cè)定了dCK酶的活性程度、dCK的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示dCK是吉西他濱敏感性的重要預(yù)后標(biāo)志物，其蛋白質(zhì)水平與dCK活性(P＜0.001)和吉西他濱敏感性(P＜0.001)均顯著相關(guān)；Hapke等人[22]通過(guò)用含有dCK或LacZ cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNPO感染三個(gè)腫瘤細(xì)胞系MCF-7，HT-29和H1437并測(cè)量了對(duì)核苷類似物的相應(yīng)敏感性證明了在體外致敏的實(shí)體腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染dCK基因可能是治療這些惡性腫瘤的有用輔助手段；Blackstock等人[23]通過(guò)高效液相色譜(HPLC)和氟19磁共振波譜(F-19 MRS)檢查了HT-29人結(jié)腸癌異種移植物中裸鼠中dFdCyd/dFdCTP 的攝取和清除情況，發(fā)現(xiàn)dCK異種移植物在吉西他濱治療后敏感性增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的腫瘤生長(zhǎng)延遲；Ricci等人[24]通過(guò)對(duì)44例胰腺癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示dCK蛋白的表達(dá)程度與吉西他濱化療患者的年齡、性別、OS和DFS有密切的關(guān)系，并且顯示出一系列的標(biāo)記強(qiáng)度，范圍從1+到3+，認(rèn)為dCK蛋白是一種與胰腺癌吉西他濱化療療效有關(guān)聯(lián)的標(biāo)志物，吉西他濱治療后dCK表達(dá)降低，總體生存率提高，另外該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)dCK蛋白主要集中于細(xì)胞核中，而先前的研究者則通過(guò)對(duì)44例胰腺癌患者的脫氧胞苷激酶(dCK)進(jìn)行免疫組織化學(xué)評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)44例中有40例dCK陽(yáng)性，并且dCK表達(dá)低與年齡增長(zhǎng)，女性，以及患者總體生存率下降顯著相關(guān)，且指出dCK蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的定位部[25]。Stegmann等人[26]將野生型脫氧胞苷激酶(dCK)cDNA轉(zhuǎn)染到克隆來(lái)源的阿糖胞苷(AraC)和地西他濱耐藥的大鼠白血病細(xì)胞系中，結(jié)果顯示可完全恢復(fù)藥物敏感性；Manome等人[27]發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體介導(dǎo)的dCK的cDNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)均導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系對(duì)ara-C的體外細(xì)胞毒性的敏感性提高，用dCK轉(zhuǎn)導(dǎo)的已建立的皮內(nèi)和腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的ara-C治療可在體內(nèi)產(chǎn)生顯著的抗腫瘤作用；Marechal等人[28]進(jìn)行的dCK蛋白表達(dá)相關(guān)的免疫組化檢測(cè)，認(rèn)為dCK蛋白的表達(dá)與胰腺癌患者的術(shù)后生存率和無(wú)瘤生存率有關(guān)，可作為獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因素。

然而上述研究中多采用生存時(shí)間和總體生存率對(duì)胰腺癌患者核苷類藥物化療敏感性評(píng)估，用兩個(gè)同一類的評(píng)估指標(biāo)去評(píng)估吉西他濱化療敏感性說(shuō)服力不足，因?yàn)樵谂R床治療中由于癌癥患者的生理機(jī)能、免疫功能等存在個(gè)體化差異，這些個(gè)體化差異也會(huì)導(dǎo)致患者對(duì)化療藥物的敏感性出現(xiàn)差別，故不能單純靠生存率和生存時(shí)間來(lái)精準(zhǔn)預(yù)測(cè)吉西他濱化療對(duì)于胰腺癌患者作用的敏感性。且目前關(guān)于此類課題的研究中缺少探討dCK蛋白通路下游的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制，關(guān)于dCK基因及蛋白表達(dá)是如何來(lái)影響吉西他濱等核苷類藥物的敏感性的具體機(jī)制沒(méi)有進(jìn)行深一步的研究，這也為以后的探索提供了方向。