劉 定，潘富珍，楊沈秋,2，張 禹,2

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

肝纖維化是一種損傷修復(fù)反應(yīng)，其形成過程伴隨肝細(xì)胞損傷，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的積累，病理過程具有動態(tài)演變的特點。適度的自噬是細(xì)胞抵御外界有害刺激的生理反應(yīng)，而自噬穩(wěn)態(tài)失衡是肝纖維化疾病進(jìn)展的重要影響因素。近年來，中醫(yī)藥治療肝纖維化已經(jīng)積累了大量臨床和實驗證據(jù)，在肝纖維化的治療中引入整體觀符合其病理特征?！端貑枴び駲C(jī)真臟論》有云：“五臟相通，移皆有次，五臟有病，則各傳其所勝……肝受氣于心，傳之于脾，氣舍于腎，至肺而死?！睆摹拔迮K相關(guān)”理論分析，肝血瘀滯、肝病傳脾、脾虛濕阻、肝腎虧損為肝纖維化的基本演變規(guī)律，肝脾腎同治法為其重要的治療方法。結(jié)合中醫(yī)學(xué)“以平為期”的治療理念，肝脾腎同治法可能通過重塑細(xì)胞自噬穩(wěn)態(tài)達(dá)到抗纖維化的作用，但其作用機(jī)制尚未闡明。本文基于“五臟相關(guān)”學(xué)說，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，就其具體理論探討如下。

1 肝臟微循環(huán)障礙可能是肝纖維化“肝血瘀滯”的微觀病理表現(xiàn)

肝臟微循環(huán)主要由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)、HSCs、肝巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和ECM五個部分組成，在維持肝細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)血管張力、控制炎癥、免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。肝臟微循環(huán)功能障礙是慢性肝病進(jìn)展為肝纖維化乃至肝硬化及其主要并發(fā)癥門脈高壓的機(jī)制之一[1]。LSECs是一種高度特化的內(nèi)皮細(xì)胞，代表著一側(cè)的血細(xì)胞與另一側(cè)的肝細(xì)胞和HSCs之間的界面，約占肝細(xì)胞的15%～20%[2]。LSECs具有特殊的窗孔樣結(jié)構(gòu)，無隔膜，直徑范圍為100～150 nm，缺乏基底膜，具有高度通透性[3]。在正常肝臟中，LSECs將血細(xì)胞保留在血管中，而代謝物、血漿蛋白、藥物、脂蛋白和較小的病毒(<200 nm)等分子可以進(jìn)入Disse空間，被肝細(xì)胞和HSCs利用[4]。此外，LSECs具有血管活性[5]、抗炎[6]和免疫功能[7]，對于肝臟維持正常的生理功能具有重要作用。LSECs主要通過肝竇毛細(xì)血管化、血管收縮、血管生成和血管分泌信號四個功能在慢性肝病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。正常情況下，肝細(xì)胞和HSCs旁分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有助于LSECs維持窗孔化表型，而分化的LSECs正是維持HSCs靜止表型的重要因素。在肝細(xì)胞損傷的情況下，持續(xù)的肝臟炎癥驅(qū)動LSECs去分化為毛細(xì)血管表型，釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)激活HSCs[6，9]。激活的HSCs上調(diào)VEGF的表達(dá)，這是LSECs的一個強(qiáng)大的促血管生成信號。反過來，來自于LSECs的自分泌VEGF信號加重了“LSECs毛細(xì)血管化-HSCs激活-促進(jìn)LSECs毛細(xì)血管化”的惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致肝竇毛細(xì)血管化和纖維化形成[10]。LSECs是內(nèi)皮源性一氧化氮(NO)的主要來源，NO是重要的血管張力調(diào)節(jié)劑，由內(nèi)皮型一氧化氮合酶產(chǎn)生[11]。在正常情況下，內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)錄因子Kruppel樣因子2(Kruppel-like factor 2,KLF2)能誘導(dǎo)LSECs產(chǎn)生NO來響應(yīng)增加的切應(yīng)力，以減緩血壓的增高，從而維持較低的門靜脈壓力[8]。在肝損傷引起氧化應(yīng)激條件下，NO信號和NO對鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)的親和力受到干擾，這導(dǎo)致LSECs功能障礙和肝內(nèi)血管收縮[10]。生理上，肝細(xì)胞分泌的VEGF通過旁分泌機(jī)制激活VEGFR2促進(jìn)LSECs增殖，調(diào)節(jié)LSECs的血管通透性，促進(jìn)肝竇再生[12]。病理上，肝臟損傷引起的慢性炎癥導(dǎo)致組織缺氧，誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)調(diào)控的血管生成基因的轉(zhuǎn)錄，從而啟動病理性血管，導(dǎo)致肝內(nèi)血管重塑和纖維化[6]。此外，LSECs還通過釋放不同的血管分泌信號，調(diào)節(jié)肝臟再生和纖維化。急性損傷后，LSECs中趨化因子受體7(CXCR7)上調(diào)與CXCR4共同作用，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Id1，促進(jìn)再生血管分泌因子，觸發(fā)再生。相反，在四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝損傷導(dǎo)致LSECs持續(xù)激活FGFR1，抵消了CXCR7依賴的促再生反應(yīng)，有利于CXCR4驅(qū)動的促纖維化血管分泌反應(yīng)，從而引發(fā)肝纖維化[13]。肝巨噬細(xì)胞主要由枯否細(xì)胞(Kupffer cells,KCs)和浸潤的單核/巨噬細(xì)胞組成，根據(jù)局部組織微環(huán)境的不同具有致炎或抗炎兩種表型[14]。巨噬細(xì)胞是肝臟炎癥過程中的關(guān)鍵細(xì)胞，分泌高水平的氧和氮自由基來對抗入侵的微生物以及炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1 beta,IL-1β)、IL-12和IL-18，從而促進(jìn)先天免疫和獲得性免疫[15]。但是，在損傷因素持續(xù)刺激下，功能失調(diào)的巨噬細(xì)胞促進(jìn)了纖維化的發(fā)展。慢性肝損傷時，KCs和募集至肝臟的浸潤巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)激活HSCs和肌成纖維細(xì)胞[16]。同時，巨噬細(xì)胞分泌的其他細(xì)胞因子如纖維母細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、IL-6以及趨化因子CCL1、CCL2、CCL22加劇了炎癥和血管生成[17]。在肝損傷環(huán)境下，VEGF、胎盤生長因子(placental growth factor,PLGF)和PDGF是推動病理性血管生成，從而增加巨噬細(xì)胞浸潤的主要分泌因子。巨噬細(xì)胞與新形成的血管共存，并分泌細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素和生長因子激活HSCs和LSECs，同時刺激核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活性增強(qiáng)肌纖維細(xì)胞的存活，這些都將促進(jìn)ECM積累和纖維化形成[18]。在慢性肝病進(jìn)展過程中，隨著肝細(xì)胞損傷，LSECs毛細(xì)血管化，肝巨噬細(xì)胞極化，HSCs活化，ECM產(chǎn)生和沉積引起肝臟微循環(huán)功能障礙伴隨纖維化乃至肝硬化全過程。

中醫(yī)藏象學(xué)說認(rèn)為，肝藏血，主疏泄，以血為體，以氣為用，在維持機(jī)體正常生命活動中與其他臟關(guān)系密切?！杜R證指南醫(yī)案·卷一》指出：“肝為風(fēng)木之臟……體陰用陽，其性剛，主動主升，全賴腎水以涵之，血液以濡之，肺金清肅下降之令以平之，中宮敦阜之土氣以培之，則剛勁之質(zhì)得為柔和之體，遂其條達(dá)暢茂之性……”若各種原因引起肝失疏泄，木氣郁遏，則血脈不暢，形成血瘀。《問齋醫(yī)案·卷六》有云：“肝木乃東方生發(fā)之本，宜條達(dá)不宜抑郁，郁則生發(fā)之氣不振，臟腑皆失沖和……”《血證論》謂：“肝屬木，木氣沖和條達(dá)，不致遏郁，則血脈得暢。”肝纖維化中肝血瘀滯的形成和肝脾腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)。其中肝失疏泄是基礎(chǔ)，而肝郁脾虛、脾失運化、氣虛濕阻和肝病及腎、腎陽溫煦失職是肝血瘀滯加重的重要病機(jī)。在肝纖維化進(jìn)展過程中，肝血瘀滯伴隨病程始終[19-20]。研究顯示，微循環(huán)、血管內(nèi)皮功能障礙是血瘀證的生物學(xué)基礎(chǔ)[21]，而健脾活血化瘀能夠下調(diào)肝纖維化進(jìn)程中VEGF表達(dá)[22]，抑制LESCs毛細(xì)血管化[23]?？梢姡闻K微循環(huán)障礙可能是肝纖維化“肝血瘀滯”的微觀病理表現(xiàn)。

2 自噬穩(wěn)態(tài)失衡可能是肝“疏泄失調(diào)”的微觀表現(xiàn)

自噬是一個進(jìn)化上高度保守的過程，真核細(xì)胞通過它降解有缺陷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，清除細(xì)胞內(nèi)的病原體，以支持生物能量代謝和適應(yīng)壓力，保護(hù)細(xì)胞的動態(tài)平衡。大多數(shù)細(xì)胞類型中同時存在三種類型的自噬：巨型自噬、伴侶介導(dǎo)的自噬和微型自噬。巨型自噬也稱自噬，占肝損傷細(xì)胞自噬的絕大部分，是本文主要討論的類型。其特征是形成自噬小體，這些自噬小體起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體或質(zhì)膜，通過關(guān)鍵的自噬相關(guān)蛋白將降解物質(zhì)運送到溶酶體[7]。越來越多的證據(jù)表明，自噬對維持肝實質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)和非實質(zhì)細(xì)胞(HSCs、LSECs、KCs)肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用[24]。肝臟高度暴露于來自門靜脈循環(huán)的異種生物和潛在炎癥介質(zhì)，自噬具有細(xì)胞保護(hù)和抗炎作用[25]。自噬是一個主要的細(xì)胞內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)，在基礎(chǔ)條件下維持細(xì)胞內(nèi)平衡，并在調(diào)節(jié)應(yīng)激期間的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)中起著不可或缺的作用。根據(jù)細(xì)胞類型的不同，自噬在纖維化中可能有雙重作用[7]。一方面，在肝細(xì)胞和LSECs中，自噬主要作為一種抗氧化和細(xì)胞保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用，自噬有助于維持內(nèi)皮細(xì)胞表型，并在疾病早期保護(hù)LSECs免受氧化應(yīng)激，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[26-27]，在巨噬細(xì)胞和KCs細(xì)胞中，自噬的抗纖維化活性來自于抑制炎性小體NLRP3的激活和隨后的促炎和促纖維化細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的分泌[28]。另一方面，HSCs利用自噬作為脂滴降解的機(jī)制，為其活化提供能量供應(yīng)[29]。在不同條件下，自噬穩(wěn)態(tài)失調(diào)可促進(jìn)肝損傷的進(jìn)一步惡化。例如，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)患者LSECs自噬存在缺陷，這種缺陷在NASH的早期，以及在慢性肝病的晚期，都會促進(jìn)肝臟炎癥和纖維化[30]。此外，酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)患者肝臟中miR-155含量增加，影響自噬途徑中的多個基因，在溶酶體水平損害ALD的自噬通量，加重細(xì)胞損傷[31]。而在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷和纖維化中，自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)顯著增加，未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response,UPR)試圖通過刺激自噬來克服錯誤折疊的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器造成的危害。如果UPR介導(dǎo)的自噬不能提供細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，就會觸發(fā)細(xì)胞凋亡，因此ERS細(xì)胞的命運取決于UPR和自噬之間的平衡[32]。最近的研究表明，在應(yīng)激源作用下，應(yīng)激蛋白TRIB3上調(diào)，直接與自噬受體SQSTM1/p62相互作用，并干擾其與MAP1LC3/LC3和泛素化底物蛋白的結(jié)合，從而抑制自噬通量。一旦自噬受損，稱為多泡小體(multivesicular bodies,MVBs)的特定內(nèi)含體不再被引導(dǎo)到自噬途徑，而是與質(zhì)膜融合，促進(jìn)了富含INHBA/Activin A的外泌體分泌，而其正是TGF-β家族成員之一，從而導(dǎo)致HSCs的遷移、增殖和活化[33]。因此自噬穩(wěn)態(tài)失衡在肝纖維化進(jìn)展中具有重要作用。但是，直接以自噬為靶點治療肝纖維化的小分子藥物目前還缺乏針對特定類型肝細(xì)胞的載體以及如何確定給藥劑量、療程和頻率，以避免在機(jī)體中產(chǎn)生限制或誘發(fā)自噬相關(guān)的不良反應(yīng)，這增加了特異細(xì)胞選擇性靶向藥物的開發(fā)成本和難度。

從中醫(yī)藏象學(xué)說分析，肝主疏泄是肝的基本生理功能。《素問·五常政大論篇》曰：“發(fā)生之紀(jì)，是謂啟陳，土疏泄，蒼氣達(dá)，陽和布化，陰氣乃隨，生氣淳化，萬物以榮……”說明疏泄是肝氣條達(dá)的具體表現(xiàn)?！端貑枴毭握撈吩唬骸巴恋媚径_(dá)?！比梭w的氣、血、津液、精神都必須在肝臟疏泄功能正常的條件下才能發(fā)揮各自應(yīng)有的作用。肝疏泄功能正常則氣機(jī)調(diào)暢，氣血和調(diào)，臟腑器官的生理活動就能保持協(xié)調(diào)。沈金鰲在《雜病源流犀燭·肝病源流》說：“肝和則生氣，發(fā)育萬物，為諸臟之生化……”若肝疏泄功能失調(diào)，可影響氣、血、津液的運行，造成“痰”“濕”“濁”“瘀”等病理產(chǎn)物停留。結(jié)合肝臟自噬的生理功能特點，自噬失調(diào)引起的受損細(xì)胞器堆積與肝“疏泄失調(diào)”引起的內(nèi)生病理產(chǎn)物相似。在肝細(xì)胞、LSECs、KCs中自噬作為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要過程，適度自噬可以合理利用溶酶體降解自身受損細(xì)胞器，產(chǎn)生再次被細(xì)胞所利用的物質(zhì)和能量，同時抑制炎性小體的產(chǎn)生及分泌，協(xié)助機(jī)體順利度過缺氧、饑餓等應(yīng)激狀態(tài)，從而限制肝臟損傷發(fā)展，自噬過度激活或抑制則引起肝損傷加重。在活化的HSCs中脂噬過度激活引起脂滴降解為其增殖分化提供能量，同時對細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的自噬受抑制導(dǎo)致纖維性EVs釋放，導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)展[34]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠存在自噬過度激活，引起海馬神經(jīng)元損傷，而調(diào)肝法可以調(diào)節(jié)大鼠海馬組織自噬發(fā)揮抗抑郁作用[35]。柴胡疏肝散可以抑制胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞過度自噬，進(jìn)而促進(jìn)功能性消化不良大鼠胃動力[36]。 柴胡皂苷A與芍藥苷聯(lián)用能提高經(jīng)皮質(zhì)酮處理的慢性心理應(yīng)激損傷模型PC12細(xì)胞自噬活性[34]。因此自噬穩(wěn)態(tài)失衡可能是肝“疏泄失調(diào)”的微觀表現(xiàn)。

3 肝脾腎同治法重塑細(xì)胞自噬穩(wěn)態(tài)是治療肝纖維化的重要方法

肝纖維化屬中醫(yī)“脅痛”“臌脹”“癥瘕”“積聚”“肝積”等疾病范疇。病程中“肝血瘀滯”是病理基礎(chǔ)，而肝“疏泄失調(diào)”是重要病機(jī)。從“五臟相關(guān)”理論來看，肝失疏泄，肝郁脾虛，氣虛濕阻，肝病及腎，肝腎虛損是肝纖維疾病病機(jī)變化特點，肝脾腎同治是治療肝纖維化的基本方法。研究表明，健脾化痰法能提高線粒體自噬水平，對高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NASH模型具有防治作用[37]。補(bǔ)腎填精法能提高海馬神經(jīng)元自噬水平[38]，對乙肝肝硬化代償期具有一定治療作用[39]。海馬線粒體自噬減退與脾氣虛發(fā)生有關(guān)，益氣健脾活血法能降低心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)線粒體自噬[40-42]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及數(shù)據(jù)挖掘研究顯示，干預(yù)自噬的中藥以清熱、補(bǔ)益為主[43]。前期臨床研究也顯示肝脾腎同治法具有防治肝纖維化、肝硬化作用[44-47]，因此肝脾腎同治法改善肝臟微循環(huán)，重塑自噬穩(wěn)態(tài)是治療肝纖維化的重要方法。

4 小 結(jié)

肝纖維化是慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段，目前仍然是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題。肝纖維化形成機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換和分子間的平衡失調(diào)，單一阻斷某一信號通路的藥物不能排除其他代償或負(fù)反饋機(jī)制的影響，這也是長期以來肝纖維化缺乏明確臨床用藥的原因之一。同時，由于自噬在不同的細(xì)胞表型中具有雙重作用，這增加了選擇性抑制劑的開發(fā)難度，如何利用這些復(fù)雜的信號機(jī)制來促進(jìn)適應(yīng)性組織修復(fù)和動態(tài)平衡是今后研究要解決的問題。中醫(yī)藥因“整體觀”和“辨證論治”在肝纖維化的治療中具有優(yōu)勢，但尚缺少中醫(yī)藥干預(yù)對自噬及其相關(guān)信號在肝纖維化中的適應(yīng)性改變方面的實驗依據(jù)?；诟卫w維化中肝臟微循環(huán)改變和“肝血瘀滯”及自噬穩(wěn)態(tài)失衡和肝“疏泄失調(diào)”的密切聯(lián)系，結(jié)合肝纖維化病程中肝脾腎功能失調(diào)的中醫(yī)病機(jī)特點及“以平為期”的中醫(yī)治療思想，課題組下一步將進(jìn)一步通過動物實驗明確肝脾腎同治法干預(yù)對肝纖維化中細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用，同時通過蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)研究中醫(yī)“以平為期”治療理念在肝纖維化中促適應(yīng)性組織修復(fù)作用的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)，以期闡明肝脾腎同治法重塑細(xì)胞自噬穩(wěn)態(tài)抗肝纖維化的分子機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。