榮 芳, 吳 峰, 周 俊

(1. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;2. 大連醫(yī)科大學(xué)研究生院, 遼寧 大連, 116044)

肺炎克雷伯菌(KP)為腸桿菌屬，根據(jù)毒力特點(diǎn)的不同，可分為普通型肺炎克雷伯菌(cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hvKp)[1-2]。cKp屬于一種常見(jiàn)的醫(yī)院內(nèi)感染病原體，是引起嚴(yán)重呼吸道感染的重要病原菌之一，容易引發(fā)消化道、皮膚、泌尿道、血液等部位感染[3], 在長(zhǎng)期使用抗菌藥物、侵入性治療、留置導(dǎo)管等原因?qū)е聶C(jī)體免疫力低下的人群中，機(jī)會(huì)性感染概率更高[4-5]。而hvKp在社區(qū)相關(guān)感染中更常見(jiàn)，壞死性肺炎、化膿性肝膿腫、內(nèi)源性眼內(nèi)炎、腦膜炎、脾膿腫等社區(qū)常見(jiàn)疾病的發(fā)生與hvKp感染有關(guān)[6]。

近年來(lái)，抗菌藥物的泛用和濫用，使得KP對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等臨床上使用頻率較高的抗生素均產(chǎn)生了不同程度的耐藥，多重耐藥菌成為臨床亟需攻克的難題[7]。碳青霉烯類(lèi)抗生素是臨床治療多重耐藥菌的重要武器，但隨著抗菌藥物的不合理使用, KP對(duì)多種抗生素均出現(xiàn)了耐藥[8]。隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物在臨床上的推廣使用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的分離率逐年上升，其感染控制難度大，病死率高[9]。替加環(huán)素(TGC)作為一種極少數(shù)對(duì)多重耐藥菌有良好效能的藥物，上市后不久就發(fā)現(xiàn)了耐藥菌株，給臨床治療和院感防控帶來(lái)了挑戰(zhàn)，本文就TGC耐藥CRKP菌株(T-CRKP)的耐藥機(jī)制研究情況展開(kāi)綜述，以期為預(yù)防與控制該菌的傳播和流行提供依據(jù)。

1 CRKP的流行現(xiàn)狀

臨床上投入使用碳青霉烯類(lèi)藥物以來(lái)，耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌(CRE)在世界范圍內(nèi)的暴發(fā)和流行越來(lái)越多被報(bào)道。流行病學(xué)調(diào)查顯示，CRKP是國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的CRE, 而且由CRKP造成的患者血流感染病死率非常高。美國(guó)疾控中心(CDC)數(shù)據(jù)[10]顯示, 2001—2011年美國(guó)CRE比率從1.2%增至4.2%, CRKP分離率從1.6%增至10.4%, 2016年歐洲CDC報(bào)告顯示，歐洲國(guó)家的CRKP分離率浮動(dòng)為0～66.9%。2005—2018年中國(guó)KP對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，其中KP對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率從3.0%和2.9%分別上升到25.0%和26.3%; 2019年和2020年KP對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥率雖然呈連續(xù)下降趨勢(shì)，但其檢出率仍超過(guò)23.0%[11], 以上數(shù)據(jù)表明中國(guó)耐藥菌株的控制情況不容樂(lè)觀。目前中國(guó)臨床CRKP流行克隆處于動(dòng)態(tài)進(jìn)化之中，但是在穩(wěn)定遺傳情況下出現(xiàn)向高毒力和高耐藥方向進(jìn)化的端倪，并已在全國(guó)許多地區(qū)播散，需引起高度重視。

2 CRKP對(duì)替加環(huán)素的耐藥現(xiàn)狀

TGC是一種半合成苷氨酰環(huán)素，為米諾環(huán)素的衍生物之一，是在米諾環(huán)素D環(huán) C-9位置上加了側(cè)鏈，穩(wěn)定性更強(qiáng)，不僅克服了制約四環(huán)素類(lèi)抗菌療效的常見(jiàn)耐藥機(jī)制，還能應(yīng)對(duì)多重耐藥菌的感染[12]，2005年被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)使用[13], 2019年經(jīng)中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市后投入臨床使用。體外研究[14]表明TGC對(duì)產(chǎn)KPC酶和金屬酶的腸桿菌科的抗菌效能達(dá)到100%。TGC不僅對(duì)腸桿菌科細(xì)菌具有廣譜高效的抗菌效能，而且對(duì)大多數(shù)革蘭陰性菌尤其是耐藥菌均具有顯著的抗菌活性，被認(rèn)為是應(yīng)對(duì)革蘭陰性菌多重耐藥的最后一道屏障[15-16]。

目前臨床上多以TGC、多黏菌素作為CRKP感染治療的保底用藥, 2015年由FDA批準(zhǔn)上市的頭孢他啶/阿維巴坦也可以用來(lái)治療CRKP患者[17]。但是由于多粘菌素、頭孢他啶/阿維巴坦臨床治療費(fèi)用較高, TGC仍是目前臨床治療CRKP感染的第一選擇，其應(yīng)用給CRKP感染的治療帶來(lái)了顯著效果。但作為治療CRKP的最后手段, TGC的用量亦在逐步攀升，與此同時(shí)帶來(lái)的耐藥問(wèn)題也日益凸顯，其上市投入臨床后不久就出現(xiàn)了耐藥菌株[18]。雖然全球各地的耐藥案例統(tǒng)計(jì)結(jié)果不盡相同，但總體上耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，使得KP感染幾乎陷入無(wú)藥可治的困境。

3 CRKP對(duì)TGC的耐藥機(jī)制

自TGC上市應(yīng)用以來(lái)，臨床上發(fā)現(xiàn)的T-CRKP菌株逐漸增多。T-CRKP耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，近年來(lái)關(guān)于T-CRKP菌株已有相關(guān)研究，但其具體耐藥機(jī)制目前尚未明確?；仡檱?guó)內(nèi)外相關(guān)研究，可大致分為以下幾類(lèi)。

3.1 RND型外排泵過(guò)表達(dá)

外排泵是位于細(xì)菌內(nèi)膜的一種主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，細(xì)菌可以借助這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體將進(jìn)入胞內(nèi)的抗菌藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞，通過(guò)降低抗菌藥物濃度達(dá)到耐藥的效果，其在KP中普遍存在且分布廣泛。腸桿菌科中報(bào)道較多的耐藥機(jī)制是AcrAB-Tolc和 OqxAB的過(guò)表達(dá)以及新發(fā)現(xiàn)的KpgABC外排泵的過(guò)表達(dá)。

AcrAB-Tolc外排泵在RND型外排泵中最常見(jiàn)，由外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrAB、通道蛋白Tolc、膜融合蛋白AcrA 3個(gè)部分組成，本質(zhì)上是一個(gè)質(zhì)子依賴型的多藥耐藥泵，以消耗質(zhì)子動(dòng)力的方式將抗菌藥物從菌體排出。關(guān)于AcrAB-Tolc外排泵的研究也比較透徹，在大腸桿菌、沙門(mén)氏菌的研究中已對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了明確闡述，其作為一種抗菌藥物外排泵，對(duì)進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)的氯霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)以及在漿液中發(fā)揮抗菌活性的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素均具有良好的識(shí)別與外排作用。先前研究[19]表明, AcrAB-Tolc外排泵中ramA、mraA、soxA、rob等調(diào)控基因表達(dá)的產(chǎn)物屬于AraC/XylS調(diào)控蛋白家族，可起到上調(diào)acrAB-tolC基因表達(dá)的作用，而acrR基因編碼的蛋白可下調(diào)acrAB-tolC的表達(dá)[20]。在AcrAB-Tolc外排泵的間接調(diào)控作用中,ramR、marR、soxR調(diào)控基因分別與ramA、marA、soxS的轉(zhuǎn)錄抑制因子一一對(duì)應(yīng)，通過(guò)抑制acrAB-tolC上調(diào)基因的表達(dá)進(jìn)而阻止外排泵AcrAB的合成來(lái)發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用[21]。若ramR發(fā)生基因突變、RamR表達(dá)量減少或下降，其對(duì)ramA基因產(chǎn)生的抑制效能就會(huì)降低, RamA的表達(dá)量會(huì)增加, AcrAB-TolC也會(huì)因此過(guò)表達(dá)。外排泵的過(guò)表達(dá)使得TGC難以進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)發(fā)揮作用，從而產(chǎn)生了耐藥性。

同屬于RND 家族的OqxAB外排泵，是一種由質(zhì)粒編碼的蛋白產(chǎn)物，最早研究發(fā)現(xiàn)與喹諾酮類(lèi)耐藥相關(guān)，現(xiàn)經(jīng)研究證實(shí)與腸桿菌科細(xì)菌發(fā)生多重耐藥(MDR)也有一定關(guān)系。OqxAB同樣有其表達(dá)調(diào)控基因rarj與oqxR等, OqxAB的過(guò)表達(dá)可使進(jìn)入菌體內(nèi)多種藥物的敏感性降低，如替加環(huán)素、喹諾酮類(lèi)、呋喃妥因和氯霉素等[22], 從而產(chǎn)生耐藥效果。

KpgABC外排泵是RND家族新成員，于2014 年被NIELSEN L E等[23]首次發(fā)現(xiàn)，之后JUAN C H等[24]在KP菌血癥患者中發(fā)現(xiàn)kpgABC基因的過(guò)表達(dá)會(huì)提升替加環(huán)素的耐藥率，且通過(guò)克隆轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)證明不需要其他外排泵的輔助也可獨(dú)立發(fā)揮排菌作用，雖然沒(méi)有達(dá)到EUCAST判斷標(biāo)準(zhǔn)，但KP對(duì)替加環(huán)素的MIC明顯增加。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)T-CRKP的耐藥性研究有了新的進(jìn)展，但是目前關(guān)于KpgABC外排泵的其他研究還十分有限。

3.2 四環(huán)素耐藥相關(guān)基因突變

TGC是新一代四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物，最早研究發(fā)現(xiàn)可有效地克服四環(huán)素類(lèi)傳統(tǒng)耐藥機(jī)制，而AKIYAMA T等[25]研究發(fā)現(xiàn)沙門(mén)菌攜帶的tetA基因不僅對(duì)四環(huán)素耐藥，也會(huì)使替加環(huán)素對(duì)細(xì)菌的敏感性降低。后來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌中的Tet蛋白均可以通過(guò)突變對(duì)替加環(huán)素產(chǎn)生抗性。其中，TetA和TetX對(duì)替加環(huán)素產(chǎn)生高水平抗性，而TetK和TetM對(duì)其產(chǎn)生低水平抗性。研究[26]表明TetX能夠表達(dá)一種依賴于黃素的單加氧酶，這種酶可對(duì)替加環(huán)素進(jìn)行羥基化修飾，使得替加環(huán)素在弱酸環(huán)境中失去穩(wěn)定性而喪失抗菌活性，但是有關(guān)該基因的作用機(jī)制還未在KP中有所報(bào)道。外排泵TetA、核糖體保護(hù)蛋白TetM、以及MFS外排泵編碼基因tetL, 也被證實(shí)在一些細(xì)菌中對(duì)替加環(huán)素產(chǎn)生了耐藥，但是在KP中未有發(fā)現(xiàn)。目前僅發(fā)現(xiàn)T-CRKP的耐藥性與變異型和外排泵表達(dá)有關(guān)[27]。

3.3 結(jié)合位點(diǎn)突變

TGC的抗菌機(jī)制是通過(guò)可逆性結(jié)合細(xì)菌核糖體的30S亞基，干擾16S rRNA的A位點(diǎn)，從而阻斷tRNA進(jìn)入核糖體A位點(diǎn)，終止氨基酸進(jìn)入肽鏈，抑制翻譯過(guò)程，最終抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)30S亞基中的S10蛋白由rpsj基因表達(dá)，若rpsj基因發(fā)生改變就會(huì)使TGC的靶向作用位點(diǎn)缺失，細(xì)菌與抗菌藥物的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變從而產(chǎn)生耐藥。rpsj基因突變導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥不同于主動(dòng)外排泵耐藥機(jī)制，具有高度特異性，是多種細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素耐藥的靶點(diǎn)[30]。之后HE F等[31]通過(guò)轉(zhuǎn)化互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)了rpsj基因突變是導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥的主要機(jī)制，而且為該基因的突變?cè)斐蒀RKP感染患者在使用替加環(huán)素治療期間產(chǎn)生耐藥首次提供直接的體內(nèi)證據(jù)。

3.4 細(xì)菌細(xì)胞膜變異

細(xì)菌細(xì)胞膜主要由糖脂、磷脂和蛋白質(zhì)3種物質(zhì)構(gòu)成?？咕镔|(zhì)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)主要是通過(guò)細(xì)菌膜上的膜孔蛋白，當(dāng)膜孔蛋白基因發(fā)生突變時(shí)，膜孔蛋白的編碼數(shù)量就會(huì)減少或其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞的通透性降低，抗菌物質(zhì)因難以進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)發(fā)揮作用從而產(chǎn)生耐藥[32]。但在大多數(shù)情況下，膜孔蛋白變異不會(huì)單獨(dú)產(chǎn)生耐藥菌株，往往與其他耐藥機(jī)制共同發(fā)揮作用。此外，催化磷脂合成的酶PlsC是一種跨膜蛋白，具有滲透作用[33]。PlsC基因突變會(huì)使磷脂合成受限，細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性降低，從而使得細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性減弱產(chǎn)生耐藥[34]。

4 CR-hvKP對(duì)替加環(huán)素的耐藥機(jī)制

與cKp的高耐藥率相比, hvKp對(duì)抗菌藥物的耐藥性相對(duì)較低。目前關(guān)于hvKp菌株及其耐藥性的研究相對(duì)較少，其流行病學(xué)特征及致病性存在許多不確定性。綜合目前相關(guān)研究, CR-hvKP菌株的耐藥機(jī)制大致分為以下2類(lèi): hvKp菌株獲得性耐藥或其耐藥性通過(guò)獲得耐藥質(zhì)粒產(chǎn)生，相關(guān)機(jī)制尚未完全明確。有研究表明, AcrB外排泵介導(dǎo)的耐藥在hvKp菌株中也得到了證實(shí)。HUANG Y H等[35]研究發(fā)現(xiàn)，hvKp菌株的外排泵基因acrB及其調(diào)控基因ramA過(guò)表達(dá)，并且由于ISKpn26序列插入AcrB的負(fù)調(diào)控基因acrR和ramR中，使得acrR和ramR發(fā)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致hvKp對(duì)替加環(huán)素產(chǎn)生耐藥。

5 小結(jié)與展望

近年來(lái)由于細(xì)菌對(duì)廣譜抗菌藥物耐藥性的增加，曾被作為控制感染最后防線的碳青霉烯類(lèi)抗生素用藥比例大幅度上升。上述關(guān)于T-CRKP耐藥機(jī)制的研究，可以為臨床防治T-CRKP提供一定的參考價(jià)值。但是新型抗生素的研發(fā)上市遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上細(xì)菌耐藥性的進(jìn)展速度，因此抗生素的合理使用非常重要。臨床治療中應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果針對(duì)不同個(gè)體采取不同的用藥措施，做到有針對(duì)性的治療，且臨床醫(yī)師和感控人員應(yīng)強(qiáng)化無(wú)菌觀念，盡量減少有創(chuàng)操作，做好全方位的感染防控工作，如加強(qiáng)手衛(wèi)生、定期監(jiān)測(cè)耐藥菌感染，并實(shí)時(shí)上報(bào)、做好感染者的隔離防護(hù)等，避免院內(nèi)交叉感染的發(fā)生。目前T-CRKP的耐藥機(jī)制研究尚未完全明確，需進(jìn)一步探究，治療上當(dāng)前可選用的抗生素包括磷霉素、慶大霉素和多黏菌素等，以及新型復(fù)合型抗生素如頭孢他啶、阿維巴坦等。相信隨著研究聯(lián)合臨床調(diào)查的深入，會(huì)出現(xiàn)更有效的抗生素來(lái)應(yīng)對(duì)T-CRKP感染。