馮小紅, 張璐璐, 薛慶亮

(1. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 甘肅 蘭州, 730050;2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 寧夏 銀川, 750004)

細(xì)胞內(nèi)病原體結(jié)核分枝桿菌(MTB)與其人類宿主長(zhǎng)期共同進(jìn)化，盡管人類的MTB感染率很高，但僅有少數(shù)感染者發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病，宿主免疫系統(tǒng)在疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。結(jié)核性胸膜炎(TP)是肺外結(jié)核的常見表現(xiàn)形式，也是淋巴細(xì)胞滲出性胸腔積液的常見病因。TP患者存在的主要炎癥模式與輔助性T細(xì)胞(Th)1型免疫應(yīng)答密切相關(guān), γ干擾素(IFN-γ)作為活化的淋巴細(xì)胞分泌的重要效應(yīng)因子在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。對(duì)IFN-γ依賴性免疫應(yīng)答進(jìn)行深入了解，有望為TP的診斷及治療提供新的思路。

1 IFN-γ概述

1.1 IFN-γ的產(chǎn)生及信號(hào)傳導(dǎo)

IFN-γ是具有抗微生物、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的多效細(xì)胞因子，主要由活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其受體在幾乎所有細(xì)胞類型中普遍表達(dá)。作為Ⅱ型干擾素家族的唯一成員, IFN-γ本質(zhì)是由IFNG基因所編碼的蛋白質(zhì)，具有生物活性的IFN-γ是由2個(gè)17 kDa多肽亞基以非共價(jià)形式結(jié)合形成的同型二聚體，在合成過程中，經(jīng)過多次氨基末端糖基化修飾, 2個(gè)亞基以反向平行方式構(gòu)成1個(gè)成熟的50 kDa分子[2]。Janus激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)途徑是與IFN-γ密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)傳導(dǎo)通路, IFN-γ通過激活胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域分別與JAK1和JAK2相關(guān)聯(lián)的IFNGR1和IFNGR2亞基組成的受體，刺激下游信號(hào)傳導(dǎo)成分JAK, 活化的JAK蛋白誘導(dǎo)STAT1轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化、激活和二聚化，新形成的STAT1同源二聚體易位至細(xì)胞核，與IFN-γ激活位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄并介導(dǎo)多種生物學(xué)應(yīng)答[3]。

1.2 IFN-γ與免疫細(xì)胞

IFN-γ是巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵激活因子，可刺激巨噬細(xì)胞向M1促炎表型極化, IFN-γ活化的巨噬細(xì)胞上調(diào)抗原呈遞和吞噬能力， 增加超氧自由基和一氧化氮的產(chǎn)生，增加促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及細(xì)胞內(nèi)病原體的消除[4]。樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)作為功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，是T細(xì)胞免疫反應(yīng)啟動(dòng)的關(guān)鍵。IFN-γ參與調(diào)節(jié)DC細(xì)胞的分化和成熟，還可以劑量依賴性方式降低DC細(xì)胞的存活率，在限制抗原呈遞和防止T細(xì)胞過度活化及衰竭中起重要作用[5]。IFN-γ與CD4+T細(xì)胞相互作用刺激其向Th1型亞群分化，通過激活下游信號(hào)增加STAT1的活性及其轉(zhuǎn)錄靶T-bet表達(dá), T-bet可上調(diào)白細(xì)胞介素(IL)-12受體和IFN-γ的表達(dá)，形成正反饋回路促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化[6]。T-bet還能通過抑制GATA3的活性限制CD4+T細(xì)胞向Th2和Th17分化[7]。IFN-γ在調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞毒性效應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用，且IFN-γ還被發(fā)現(xiàn)能夠抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖及功能，但其具體機(jī)制尚待闡明。IFN-γ作用于B淋巴細(xì)胞可促進(jìn)與吞噬細(xì)胞上的Fcγ受體結(jié)合的免疫球蛋白G(IgG)亞類的轉(zhuǎn)換，激活補(bǔ)體，有助于吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的微生物清除[8]。IFN-γ影響機(jī)體微環(huán)境中不同免疫細(xì)胞的行為，充當(dāng)免疫細(xì)胞復(fù)雜關(guān)系的中間因子，在維持穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。

2 IFN-γ依賴性免疫應(yīng)答與TP

2.1 IFN-γ與MTB感染

自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞(MAIT細(xì)胞)、γδ T細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞通過破壞受感染的細(xì)胞并分泌調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子在抵御MTB感染的固有免疫應(yīng)答中起核心作用。IL-2、IL-12對(duì)于NK細(xì)胞的活化具有重要調(diào)節(jié)作用，有研究[9]發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化并增加IL-12分泌，由此建立一個(gè)正反饋回路，形成有利于Th1型免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子微環(huán)境。作為獲得有效T細(xì)胞免疫所需細(xì)胞因子的早期來源, MAIT細(xì)胞可從循環(huán)中募集至感染局部，通過直接識(shí)別微生物配體或在炎性細(xì)胞因子刺激下激活，分泌INF-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等效應(yīng)分子發(fā)揮免疫保護(hù)作用[10]。MTB可破壞巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞，從而繞過CD4+T細(xì)胞活化，而MAIT細(xì)胞優(yōu)先響應(yīng)先天性炎癥信號(hào)，通過表達(dá)IFN-γ等細(xì)胞因子激活巨噬細(xì)胞并募集包括抗原特異性CD4+T細(xì)胞在內(nèi)的其他免疫細(xì)胞，可能在規(guī)避MTB的免疫逃逸機(jī)制中起重要作用[11]。磷酸抗原特異性Vγ2Vδ2 T細(xì)胞僅存在于人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，其占人體循環(huán)中γδ T細(xì)胞總數(shù)的65%～90%, 具有響應(yīng)MTB迅速增殖并產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性顆粒分子的能力，是感染期間主要的MTB反應(yīng)性γδ T細(xì)胞，發(fā)揮重要的擴(kuò)增和效應(yīng)作用[12]。關(guān)于人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，活化的Vγ2Vδ2 T細(xì)胞可被IL-2、IL-12、IL-15、IL-21等多種細(xì)胞因子顯著擴(kuò)增，其蓄積在感染部位以IFN-γ或TNF-α依賴性方式抑制細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌的生長(zhǎng)，能有效降低MTB負(fù)荷及減少相關(guān)的肺組織病理改變。

CD4+T和CD8+T細(xì)胞亞群是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要組成部分，在經(jīng)歷激活、增殖和分化后可迅速產(chǎn)生并分泌IFN-γ發(fā)揮細(xì)胞免疫作用。有研究[15]縱向比較了活動(dòng)性肺結(jié)核患者口服抗結(jié)核藥物強(qiáng)化治療2個(gè)月前后表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的百分比，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞百分比無顯著變化，這反映了CD8+T細(xì)胞在控制MTB感染中的可能作用，與分泌IFN-γ相比，其主要起細(xì)胞毒性效應(yīng)的功能。GREEN A M等[16]通過小鼠過繼轉(zhuǎn)移模型試圖確定除CD4+T細(xì)胞外其他來源的IFN-γ是否足以控制MTB感染，然而其數(shù)據(jù)表明CD4+T細(xì)胞分泌的IFN-γ對(duì)于機(jī)體獲得長(zhǎng)期最佳保護(hù)必不可少。也有報(bào)道[17]指出, CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫保護(hù)可不依賴IFN-γ的產(chǎn)生，在沒有IFN-γ刺激巨噬細(xì)胞的情況下, CD4+T細(xì)胞也能表現(xiàn)出很強(qiáng)的控制MTB生長(zhǎng)的能力。GALLEGOS A M等[18]通過動(dòng)物試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn), CD4+T細(xì)胞在感染后3周的抗MTB效應(yīng)功能可不依賴IFN-γ, 推測(cè)此過程中產(chǎn)生IFN-γ的其他免疫細(xì)胞發(fā)揮了重要作用，或者存在IFN-γ非依賴性保護(hù)機(jī)制，但需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。體內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞隨時(shí)間推移的免疫應(yīng)答機(jī)制，無論是IFN-γ依賴性還是IFN-γ非依賴性，均值得深入研究。

先天性和適應(yīng)性免疫的不同細(xì)胞亞群在抵御MTB的不同時(shí)間發(fā)揮作用，而遺傳缺陷可能影響多個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞亞群的潛在免疫作用。研究[19]發(fā)現(xiàn), MTB的易感基因確實(shí)存在，即使暴露于弱毒分枝桿菌也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重感染，這種特征被稱為分枝桿菌病的孟德爾易感性(MSMD)。截至目前，臨床已發(fā)現(xiàn)16種與MSMD相關(guān)的基因突變，而所有已知的遺傳病因都會(huì)影響IFN-γ依賴性免疫應(yīng)答。包括MARTNEZ-BARRICARTE R和CASANOVA J L等在內(nèi)的研究團(tuán)隊(duì)[20]報(bào)道了MSMD的2個(gè)常染色體隱性遺傳病因，即IL-12受體缺乏和IL-23受體缺乏。2020年該團(tuán)隊(duì)[21]再次報(bào)道了T-bet遺傳缺陷導(dǎo)致的分枝桿菌病患者的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)T-bet缺陷可影響天然免疫淋巴細(xì)胞的發(fā)育及IFN-γ的產(chǎn)生，而適應(yīng)性淋巴細(xì)胞的作用并不能彌補(bǔ)這一缺陷。以上研究的結(jié)果均突顯了免疫細(xì)胞抗MTB活性對(duì)IFN-γ的依賴性。

2.2 IFN-γ與TP的發(fā)病機(jī)制

TP發(fā)病通常被認(rèn)為是明確的胸膜感染和胸膜腔區(qū)室內(nèi)滲出性超敏反應(yīng)共同作用的結(jié)果。胸腔積液產(chǎn)生的主要機(jī)制包括胸膜下結(jié)核病灶破裂進(jìn)入胸膜腔，由MTB抗原誘發(fā)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加，蛋白質(zhì)進(jìn)入胸膜腔，局部高蛋白環(huán)境進(jìn)一步加速胸腔積液形成; 其次，胸膜炎癥可致壁層胸膜淋巴孔閉塞，減慢液體的吸收。MTB抗原進(jìn)入胸膜腔會(huì)引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，最初的特征是多形核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的迅速涌入及富集，然后是NK細(xì)胞、γδ T細(xì)胞、Th細(xì)胞及其可溶性介質(zhì)的積累[22], 此后是淋巴細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的長(zhǎng)期免疫反應(yīng)，伴隨著腺苷脫氨酶的釋放和肉芽腫的形成[23]。TP可驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生IFN-γ的NK細(xì)胞、γδ T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞等細(xì)胞亞群的明顯效應(yīng)反應(yīng)，盡管外周循環(huán)中僅發(fā)現(xiàn)少量MTB抗原特異性T細(xì)胞，但其在感染部位卻表現(xiàn)出驚人的富集，這種現(xiàn)象被稱為“區(qū)室化”[24]。一項(xiàng)研究[25]通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得TP患者胸腔積液的T細(xì)胞亞群中MAIT細(xì)胞的細(xì)胞頻率為0.91%, 與外周血相比, MAIT細(xì)胞的功能在感染局部得到了極大增強(qiáng)。LI Z T等[26]研究發(fā)現(xiàn), TP患者胸膜液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞中存在MTB特異性的CD3+TCRvβ11+NKT細(xì)胞，雖然數(shù)量顯著低于外周血單個(gè)核細(xì)胞，但胸膜液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞中的CD3+TCRvβ11+NKT細(xì)胞可表達(dá)高水平的CD69、CD25, 表明其處于高度活化狀態(tài)。感染局部IFN-γ差異表達(dá)提示了細(xì)胞運(yùn)輸和細(xì)胞因子表達(dá)的區(qū)室特異性模式，反映了產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞在疾病部位的活躍募集和克隆擴(kuò)增，高度活化的具有抗原特異性效應(yīng)的淋巴細(xì)胞聚集在病變部位發(fā)揮免疫效應(yīng)[27]。

2.3 IFN-γ及γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)與TP的診斷

在眾多引起胸腔積液的病因中, TP的診斷仍然具有挑戰(zhàn)性。由于該病的貧菌性特征，僅有少數(shù)患者能獲得明確的微生物學(xué)診斷，有時(shí)還需進(jìn)行侵入性操作。定量胸水IFN-γ水平為TP的快速診斷提供了一種有應(yīng)用前景的替代方法。一項(xiàng)薈萃分析[28]顯示，非刺激胸水IFN-γ的診斷性能表現(xiàn)出與TP經(jīng)典標(biāo)志物腺苷脫氨酶(ADA)相當(dāng)?shù)目傮w準(zhǔn)確性，展現(xiàn)出成為TP一線檢測(cè)指標(biāo)的潛力，隨著對(duì)其臨床合適閾值研究的深入，該方法可能得到更廣泛的應(yīng)用。

IGRAs通過量化T淋巴細(xì)胞響應(yīng)結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)域(RD)-1編碼的特定抗原刺激下釋放的IFN-γ, 已成為檢測(cè)結(jié)核感染的快速免疫診斷工具。目前，比較成熟的方法包括采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的全血檢測(cè)(QFT-GIT)和采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的細(xì)胞檢測(cè)(T-SPOT)2種。AGGARWAL A N等[29]系統(tǒng)地評(píng)估了基于血液和胸水的IGRAs對(duì)TP的診斷性能，均表現(xiàn)不佳。對(duì)此，有學(xué)者[30]提出疑問，其將TP患者的不確定結(jié)果歸類為假陰性可能影響了準(zhǔn)確性分析，其次2種檢測(cè)的匯總分析可能導(dǎo)致整體IGRAs在體液中診斷性能較差。由于MTB抗原特異性淋巴細(xì)胞的“區(qū)室化”特性，評(píng)估基于胸水的IGRAs可能會(huì)提高診斷特異性。LUO Y等[31]的薈萃分析顯示，胸水T-SPOT表現(xiàn)出較好的診斷性能，總體敏感性、特異性分別為0.91、0.88。TONG X等[32]也得到了相同結(jié)論，其還發(fā)現(xiàn)T-SPOT的性能優(yōu)于QFT-GIT?？傊M(jìn)一步優(yōu)化胸水IGRAs操作并將診斷標(biāo)準(zhǔn)化，可能會(huì)使結(jié)果更加可靠。

2.4 IGRAs與TP的治療監(jiān)測(cè)

研究[33]發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核治療過程中由MTB抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)的變化可以反映宿主由于抗原負(fù)荷減少而產(chǎn)生的免疫學(xué)變化, MTB的細(xì)菌載量與IFN-γ對(duì)抗原的免疫反應(yīng)程度存在關(guān)系。因此，一些研究試圖通過IGRAs測(cè)量IFN-γ反應(yīng)的變化尋找用于監(jiān)測(cè)結(jié)核藥物干預(yù)效果及評(píng)估療程的生物標(biāo)志物。CLIFFORD V等[34]發(fā)現(xiàn)，雖然通常IGRAs反應(yīng)在抗結(jié)核治療期間下降，但個(gè)體反應(yīng)間存在巨大差異，故不建議使用當(dāng)前的IGRAs監(jiān)測(cè)患者的臨床治療。POURAKBARI B等[35]的系統(tǒng)評(píng)價(jià)研究同樣沒有觀察到治療前后QFT-GIT和T-SPOT的顯著差異。ZHANG B Y等[36]通過隨訪TP患者抗結(jié)核治療基線、第6個(gè)月、第9個(gè)月的QFT-GIT結(jié)果及T淋巴細(xì)胞亞群變化，發(fā)現(xiàn)QFT-GIT值與患者癥狀持續(xù)時(shí)間和年齡相關(guān)，而Treg細(xì)胞比例的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)與不同時(shí)點(diǎn)IFN-γ反應(yīng)波動(dòng)相似，表明IFN-γ反應(yīng)受宿主免疫狀態(tài)影響，連續(xù)IGRAs可能不適合作為評(píng)估TP療效的輔助手段。

新一代IGRAs, 即QFT-GIT檢測(cè)的更新版本，稱為QFT-Plus，包含1個(gè)旨在引起CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的額外抗原管(TB2)。日本的一項(xiàng)研究[37]對(duì)招募的患者于抗結(jié)核治療后第0、3和6個(gè)月進(jìn)行QFT-Plus測(cè)試，第1個(gè)抗原管(TB1)的定量值表示CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，TB1和TB2的定量值差異替代CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)隨著抗結(jié)核治療時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。另一項(xiàng)在結(jié)核病低流行國(guó)家意大利開展的研究[38]也發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核治療降低了響應(yīng)QFT-Plus測(cè)試中抗原的IFN-γ反應(yīng)。這些研究為QFT-Plus成為治療期間的潛在輔助監(jiān)測(cè)工具提供了有用的信息，未來還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

3 展 望

調(diào)控宿主免疫應(yīng)答以治療結(jié)核病的方法前景廣闊，對(duì)宿主保護(hù)性免疫的本質(zhì)及作用機(jī)制的深入研究是其核心所在。IFN-γ及誘導(dǎo)其產(chǎn)生、釋放、作用及調(diào)節(jié)的相關(guān)細(xì)胞及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)復(fù)雜的信息傳遞系統(tǒng)，其相互作用及動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)以達(dá)到適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答水平。對(duì)微環(huán)境中各種免疫介質(zhì)的研究有助于更好地了解TP的病理生理機(jī)制，尋找能在臨床廣泛應(yīng)用并進(jìn)一步拓展的細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)指向性生物標(biāo)志物，可為TP的早期診斷提供理論依據(jù)。深入了解IFN-γ依賴性細(xì)胞免疫激活及動(dòng)態(tài)變化的具體機(jī)制，尋找刺激、擴(kuò)展優(yōu)勢(shì)淋巴細(xì)胞亞群以及誘導(dǎo)、維持抗原特異性細(xì)胞頻率的持久變化的信號(hào)通路，可為合理疫苗設(shè)計(jì)及治療提供免疫靶標(biāo)。