邢芮寧 綜述，李渠北 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶 400014)

肺炎造成兒童死亡的人數(shù)超過任何其他傳染病。根據(jù)2020年聯(lián)合國兒童基金會(huì)數(shù)據(jù)顯示，肺炎是5歲以下兒童首要死因，平均每39秒就有1例兒童死于肺炎[1]。其病原體快速且準(zhǔn)確地鑒定是兒童肺炎早期明確診斷和合理用藥的基礎(chǔ)。目前，臨床上被廣泛使用的病原學(xué)檢測(cè)方法仍然是基于19世紀(jì)80年代由巴斯德開創(chuàng)的基于培養(yǎng)的技術(shù)[2]，在檢測(cè)速度及靈敏度等方面具有較大局限性。近年來，隨著宏基因二代測(cè)序(mNGS)技術(shù)的出現(xiàn)，為明確肺炎病原體提供了一種新的檢測(cè)方法。該技術(shù)具有通量高、敏感性高的優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)檢測(cè)幾百萬到上億條核酸序列，提高了全基因組的測(cè)序速度，并降低了單個(gè)堿基測(cè)序的成本[3-5]。

1 兒童肺炎病原學(xué)檢測(cè)現(xiàn)狀

肺炎作為臨床上常見的兒童呼吸道感染性疾病,病原體包括細(xì)菌、真菌、病毒、肺炎支原體、衣原體等，種類繁多、構(gòu)成復(fù)雜。肺炎發(fā)病率高，致死率可達(dá)30%～50%，對(duì)兒童生命及健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]，早期識(shí)別病原體對(duì)指導(dǎo)肺炎的診療及改善預(yù)后具有很大幫助。

傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法包括病原分離培養(yǎng)、血清學(xué)抗體檢測(cè)、抗原檢測(cè)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)等。病原分離培養(yǎng)法作為目前臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在臨床上最為常用。該檢測(cè)技術(shù)可以檢測(cè)多種病原體，并且根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床治療給予相應(yīng)指導(dǎo)，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)，且操作過程復(fù)雜。此外，長(zhǎng)期的抗生素使用會(huì)降低培養(yǎng)敏感性，即使檢測(cè)結(jié)果為陰性，也不能完全排除感染[7]。血清學(xué)抗體檢測(cè)法通過免疫學(xué)方法明確感染后患兒免疫狀態(tài)，無須經(jīng)過培養(yǎng)，對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基下不易生長(zhǎng)的病原體具有一定檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于免疫系統(tǒng)發(fā)育不全及免疫力低下的患兒，容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果[8]。抗原檢測(cè)方法主要針對(duì)血清型較少、細(xì)胞培養(yǎng)不能增殖的呼吸道病原體，其檢測(cè)標(biāo)本范圍廣，無論是痰液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)，還是胸腔腹水均可作為標(biāo)本，其特異性高、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)時(shí)間短，對(duì)于病程中使用過抗生素治療的患兒仍可以檢測(cè)出病原體[9]，已逐漸成為兒童肺炎病原體檢測(cè)的主流方法[10-11]，但與其他檢測(cè)方法相比，其敏感性較低。PCR技術(shù)是一種體外介導(dǎo)DNA序列酶促反應(yīng)合成的分子生物學(xué)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、特異性及敏感性高等特點(diǎn)，且檢測(cè)結(jié)果幾乎不受抗生素影響，對(duì)混合感染的病原學(xué)診斷尤其適用，近年來臨床應(yīng)用價(jià)值逐漸提升。但PCR技術(shù)對(duì)操作規(guī)范和質(zhì)量控制要求嚴(yán)格，且容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，與病源分離培養(yǎng)相比，不能反映藥敏試驗(yàn)結(jié)果及耐藥性[12]。目前，臨床上各種病原體檢測(cè)方法應(yīng)用廣泛，但仍有15%～25%的肺炎患者無法明確病原學(xué)診斷。由此可見，傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法已很難滿足目前兒童肺炎診治的需求。

2 宏基因二代測(cè)序(mNGS)在兒童肺炎病原體檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)展

2.1mNGS概述 NGS是在一代Sanger測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新型測(cè)序技術(shù)。1998年RIZZO等[13]首先提出這一概念，2004年美國國立人類基因組研究所正式發(fā)起該項(xiàng)目的研究；2005年焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)首次被報(bào)道[14]；2014 年第1篇使用 NGS 檢測(cè)腦脊液標(biāo)本并明確鉤端螺旋體感染病例的國外雜志報(bào)道[15]，至此，NGS開始廣泛應(yīng)用于臨床研究。

NGS技術(shù)包括對(duì)樣本中所有的遺傳物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序的mNGS和利用基因組中特定的標(biāo)記基因(例如16S rRNA)僅對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行種系發(fā)育分析的宏分類組學(xué)。mNGS可以直接從樣本中提取其中所有的核酸序列，并進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，無須經(jīng)過培養(yǎng)[16]。因此可以邊合成邊測(cè)序，臨床操作步驟包括：臨床標(biāo)本的采集與運(yùn)輸；標(biāo)本核酸提取、DNA 和(或)RNA 富集；DNA文庫制備；高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析等步驟。

2.2mNGS的優(yōu)勢(shì) 同一代Sanger測(cè)序技術(shù)相比，mNGS通量更高，即每次測(cè)序反應(yīng)所能讀取的DNA序列的數(shù)量更多；mNGS的平均讀取長(zhǎng)度更短，使檢測(cè)每個(gè)堿基的成本更低，以常見平臺(tái)為例(BGI、Illumina、Roche、SoLiD)，mNGS平均讀取長(zhǎng)度為30～400 bp，而Sanger測(cè)序法可讀取的長(zhǎng)度范圍是500～1 000 bp[17]，這在一定程度上限制了mNGS可以進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)類型，但在過去5年里使檢測(cè)堿基成本較一代測(cè)序降低了近10萬倍以上[18]，并由此產(chǎn)生巨大的序列數(shù)據(jù)集[19]。

此外，mNGS對(duì)標(biāo)本選擇不具有偏向性，可檢測(cè)的標(biāo)本包括血液，痰液，肺泡灌洗液，腦脊液，胸、腹水等；所有已知基因組序列的病原體均可被mNGS報(bào)告，目前已被納入的病原體包括4 000余種病毒、3 000余種細(xì)菌、200 余種真菌和140余種寄生蟲[20]。越來越多的臨床證據(jù)表明mNGS正在臨床被廣泛應(yīng)用。無論是皮膚感染，還是眼部、泌尿系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)的感染，mNGS病原體檢出率均高于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)[16,21-22]；mNGS對(duì)腫瘤標(biāo)記物可以作出更加準(zhǔn)確的臨床診斷，明確致病基因，為臨床治療方案提供有利支持[23-24]。在產(chǎn)前診斷方面，mNGS利用其敏感性高的特點(diǎn)，可以對(duì)微量DNA物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前無創(chuàng)性染色體疾病篩查[25-26]。此外，與病原培養(yǎng)等方法相比，既往使用抗生素對(duì)mNGS結(jié)果影響小[27]。mNGS還可以識(shí)別罕見病原體及發(fā)現(xiàn)新的病原體，對(duì)弓形蟲、隱球菌、風(fēng)疹病毒、阿米巴原蟲等臨床檢出率低的病原體具有更高的提示性[28-30]，在多重復(fù)雜耐藥突變的檢出上也可以提供一定數(shù)據(jù)支持[31-32]。

2.3mNGS在兒童肺炎病原體檢測(cè)方面的臨床應(yīng)用 李學(xué)青等[33]回顧性分析了mNGS對(duì)重癥肺炎兒童的肺泡灌洗液標(biāo)本的病原學(xué)診斷，結(jié)果顯示：34例患兒中有32例檢出病原體(檢出率為94.1%)，經(jīng)抗感染等對(duì)癥治療后，33例患兒好轉(zhuǎn)出院，1例患兒死亡。表明mNGS 在重癥肺炎上可以提高病原檢出率，并對(duì)臨床治療起到指導(dǎo)作用。FARNAES等[34]對(duì)15例診斷為社區(qū)獲得性肺炎兒童進(jìn)行了游離血漿的mNGS，結(jié)果顯示，mNGS發(fā)現(xiàn)了13例(86%)的病原體，而在僅使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)和PCR方法的兒童中，為47%。表明mNGS與傳統(tǒng)方法比較敏感性更高。而且，在這 15 例兒童中，7 例在mNGS結(jié)果回示后調(diào)整了抗生素治療方案。說明 mNGS 亦可以提高兒童下呼吸道感染病原菌的檢出率，有利于精準(zhǔn)診療的實(shí)施。ZINTER 等[35]對(duì) 34 例免疫缺陷兒童共41份下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行mNGS，結(jié)果顯示：在傳統(tǒng)方法檢測(cè)到病原體的17例樣本中，有14例結(jié)果和mNGS結(jié)果一致，另外3例mNGS檢出了傳統(tǒng)方法未曾檢測(cè)到的病原體。在24例傳統(tǒng)方法未檢測(cè)到病原體的樣本中，有11例mNGS檢測(cè)出了可能導(dǎo)致感染的病原體，剩下的13例則未能檢測(cè)出。表明mNGS 可提高對(duì)呼吸道病原體檢測(cè)敏感性，ATKINSON等[36]研究也有相似發(fā)現(xiàn)。此外，YUN等[37]研究發(fā)現(xiàn)，mNGS早期病原體檢出率高，有助于指導(dǎo)個(gè)體化治療，降低經(jīng)驗(yàn)用藥所致的耐藥性，降低患兒病死率。

2.4兒童肺炎的mNGS標(biāo)本選擇 兒童肺炎的mNGS檢測(cè)標(biāo)本通常包括外周血、痰液、BALF、咽拭子等[38]，應(yīng)盡量在疾病早期采樣本并盡快送檢。專家共識(shí)指出，在檢出細(xì)菌及真菌方面，BALF標(biāo)本具有更高的敏感性；而在檢測(cè)病毒方面，外周血標(biāo)本檢出率更高。其中腺病毒BALF和血mNGS同時(shí)可以檢出[39]。對(duì)于EBV、CMV等不引起肺炎的病原，即使外周血檢測(cè)到也不考慮為導(dǎo)致肺炎的病原體。對(duì)于單純肺炎患者，經(jīng)支氣管鏡操作采集的BALF標(biāo)本要優(yōu)于痰和外周血標(biāo)本；而對(duì)于重癥肺炎患者，可采取多種類型樣本(血液、痰液或BALF)、多種方法學(xué)病原體培養(yǎng)、細(xì)菌/真菌涂片、PCR檢測(cè)或mNGS平行送檢，以便相互印證結(jié)果，其中優(yōu)先選送BALF標(biāo)本[40]。

2.5mNGS靈敏度及影響因素 mNGS的靈敏度與測(cè)序數(shù)據(jù)量(檢測(cè)總序列數(shù))及致病微生物基因組的堿基數(shù)呈正相關(guān)，與單位體積標(biāo)本中人源細(xì)胞含量及背景微生物基因數(shù)呈負(fù)相關(guān)。在測(cè)序數(shù)據(jù)量確定的情況下，常見影響mNGS檢測(cè)靈敏度因素包括病原體基因組大小、細(xì)胞外游離DNA(cfDNA)數(shù)目、細(xì)胞壁厚度、人源細(xì)胞占比、背景微生物占比等。其中病原體基因組越大，mNGS靈敏度越高，通常寄生蟲病原體最大，真菌次之，細(xì)菌和病毒的基因組較?。挥捎趍NGS檢測(cè)的是cfDNA，對(duì)于一些胞內(nèi)寄生病原體(如傷寒沙門菌等)檢出率較低[41]；結(jié)核分枝桿菌(MTB)等細(xì)胞壁較厚的細(xì)菌，核酸提取率低，導(dǎo)致檢出靈敏度降低，在眾多病原體中，病毒核酸提取率最高，細(xì)菌次之，真菌及MTB核酸提取率相對(duì)較低；人源細(xì)胞占比及背景微生物占比也是影響靈敏度2個(gè)重要因素。就肺炎檢測(cè)標(biāo)本而言，BALF的人源細(xì)胞占比少于外周血，痰液的人源細(xì)胞占比更高；背景微生物主要包括定植微生物和污染，其不僅影響mNGS檢測(cè)結(jié)果，還對(duì)傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生干擾[31,42-44]。

3 mNGS目前存在的問題

3.1結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) mNGS雖然可識(shí)別臨床樣品中的全部病原體，但由于不同種類的微生物基因組長(zhǎng)度不同，不同平臺(tái)之間無統(tǒng)一質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，目前對(duì)于mNGS報(bào)告尚無統(tǒng)一的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，而是由臨床醫(yī)生結(jié)合癥狀綜合判定[31,43-44]。

3.1.1陽性閾值的界定 多篇專家共識(shí)指出，對(duì)于檢出的可能致病微生物不能只關(guān)注序列數(shù)的多少，需結(jié)合該序列在基因組的覆蓋度和特異性進(jìn)行評(píng)判[43,45]。一般序列數(shù)和致病可能性成正比，以及檢出序列數(shù)越高，致病可能性越大，而對(duì)于極少存活于環(huán)境中的病毒，即使檢出少量的特異序列(<3條)就可判為陽性[43]。對(duì)于MTB、布魯氏桿菌等檢測(cè)難度較大的病原體，檢出1條特異序列即可判為陽性[27,44]。

3.1.2致病菌、定植菌和污染菌的區(qū)分 定植微生物廣泛存在于人體及檢測(cè)環(huán)境中，這是擁有高敏感性的mNGS檢測(cè)過程中無法避免的，往往會(huì)將真正導(dǎo)致疾病的病原體掩蓋，因此，當(dāng)考慮條件致病菌時(shí)，應(yīng)首先分析臨床患兒的基礎(chǔ)疾病、免疫狀態(tài)及標(biāo)本的來源。對(duì)于檢出大量的雜菌序列而沒有主導(dǎo)的微生物時(shí)，則首先考慮污染菌，其次考慮為條件致病菌[46]。

3.1.3假陰性結(jié)果與假陽性結(jié)果分析 對(duì)于臨床癥狀符合，且其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法高度提示的病原體，即使mNGS結(jié)果為陰性，也不能排除感染可能，可根據(jù)臨床需要必要時(shí)再次行mNGS檢測(cè)；而對(duì)于mNGS檢測(cè)為陽性，而臨床癥狀不支持的檢測(cè)結(jié)果，需結(jié)合其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估，并以傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為首選參考依據(jù)[46]。

3.2對(duì)RNA病原體檢出率低 DNA病毒的基因組可以通過直接從樣本中提取進(jìn)行mNGS檢測(cè)，而RNA病毒由于其遺傳物質(zhì)豐度低，易降解，需先逆轉(zhuǎn)錄為與其互補(bǔ)的DNA再進(jìn)行測(cè)序[47]。此外，人源RNA同DNA相比的豐度和復(fù)雜度更高，更易降解，對(duì)樣本運(yùn)輸和保存要求也更高。以上因素導(dǎo)致mNGS對(duì)RNA病毒的檢測(cè)率較低。在檢測(cè)前對(duì)RNA病毒進(jìn)行富集對(duì)提高檢出率有所改善。

3.3檢測(cè)周期長(zhǎng) 目前，病原微生物mNGS檢測(cè)的周期一般是72 h內(nèi)。與病原培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和一般細(xì)菌/真菌涂片等技術(shù)相比，mNGS技術(shù)可一次檢測(cè)包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等多種類型的病原體，并且不受分離培養(yǎng)的限制，在核酸序列水平對(duì)病原體進(jìn)行準(zhǔn)確分析。但是，與臨床需求相比，尤其是對(duì)于急癥患者來說，mNGS在檢測(cè)周期時(shí)長(zhǎng)上仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

3.4與其他常用實(shí)驗(yàn)室檢查相比費(fèi)用較高 雖然mNGS的檢測(cè)成本同Sanger技術(shù)相比大大降低，但與其他傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相比仍花費(fèi)巨大。目前，臨床傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的費(fèi)用在數(shù)十元至百元不等，而一次mNGS檢測(cè)需花費(fèi)上千元。高昂的檢測(cè)成本也是限制mNGS在臨床廣泛應(yīng)用的因素之一[39]。

4 結(jié)語與展望

近年來，mNGS作為一種新興的臨床病原體檢測(cè)方法，可以檢出臨床標(biāo)本中所有的病原體，通量高、敏感性高，在罕見、不典型病原體及混合感染的病原體檢出上體現(xiàn)了自己獨(dú)特的臨床價(jià)值，以上優(yōu)勢(shì)已被多篇指南及專家共識(shí)認(rèn)可并推薦臨床使用[48-51]。在兒童肺炎的病原體檢測(cè)中，mNGS提高了病原體檢出率，對(duì)早期針對(duì)治療起到指導(dǎo)作用，對(duì)縮短肺炎病程，減少并發(fā)癥具有重大意義。然而，作為一項(xiàng)新技術(shù)，mNGS仍存在一些不足之處，如檢測(cè)過程尚無統(tǒng)一質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；標(biāo)本處理復(fù)雜，一旦發(fā)生污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大；檢測(cè)成本相對(duì)較高；檢測(cè)周期長(zhǎng)，對(duì)于急危重癥患兒臨床意義較?。粚?duì)于mNGS檢測(cè)結(jié)果，需結(jié)合臨床癥狀及其他傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果共同分析等。因此，mNGS目前尚不能作為臨床常規(guī)檢測(cè)方法。但隨著相關(guān)研究不斷進(jìn)展，mNGS的不足之處將不斷改善，檢測(cè)特異度及靈敏度更高，檢測(cè)成本更低，在不久的將來有可能取代部分傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，成為臨床上兒童肺炎診斷的一項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)。