周霞 劉德智 孟瑞霞 王培山

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 1麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2 RICU)

膀胱癌(BCa)是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)是其主要治療方式，但其具有極高的復(fù)發(fā)率，導(dǎo)致患者預(yù)后不良〔1,2〕。相關(guān)研究〔3〕指出麻醉方式和麻醉藥物會(huì)影響腫瘤患者術(shù)后的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。闡述麻醉藥物、技術(shù)對術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的影響，可為臨床麻醉策略提供參考〔4〕。順阿曲庫銨是阿曲庫胺的同分異構(gòu)體之一，一種新型強(qiáng)效中時(shí)效非去極化型肌松藥，可安全用于臨床麻醉〔5〕。研究報(bào)道順阿曲庫銨通過改變p53依賴的凋亡途徑，在體外有效抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡〔6〕。順阿曲庫銨可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，抑制細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖，并促進(jìn)其凋亡〔7〕。然而順阿曲庫銨對膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制還尚未清楚。研究表明，miRNA可以作為癌基因或抑癌基因在膀胱癌中發(fā)揮作用〔8〕。miR-3666在胃癌患者中低表達(dá)，參與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，會(huì)引起胃癌患者預(yù)后不良〔9〕。circ_0018069通過攜帶包括miR-3666在內(nèi)的多種miRNA形成黏著信號通路，在膀胱癌中發(fā)揮抗癌作用〔10〕。miR-3666通過靶向溴區(qū)PHD結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(BPTF)抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲性〔11〕。miR-3666通過靶向特殊富含AT序列結(jié)合蛋白(SATB)2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔12〕。而miR-3666對膀胱癌細(xì)胞及順阿曲庫銨是否通過調(diào)控miR-3666影響膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲目前未知。本實(shí)驗(yàn)旨在研究順阿曲庫銨可能通過調(diào)控miR-3666對膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自武漢益普生物；膀胱癌細(xì)胞株T24購自上海北諾生物；MTT試劑盒由上海谷研生產(chǎn)；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒由深圳子科生物生產(chǎn)；苯磺順阿曲庫銨由江蘇恒瑞醫(yī)藥生產(chǎn)；Transwell小室、基質(zhì)膠由美國BD公司生產(chǎn)；RT-qPCR試劑盒由北京麥瑞博生物生產(chǎn)。

1.2細(xì)胞處理與分組方法 將膀胱癌細(xì)胞T24培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)期細(xì)胞。用順阿曲庫銨分組，分別采用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 順阿曲庫銨處理，分為順阿曲庫銨低(Cis-L組)、中(Cis-M組)及高濃度(Cis-H組)組，并將正常培養(yǎng)細(xì)胞記作Con組。用miR-NC、miR-3666轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞分組，分為miR-NC組和miR-3666組。用anti-miR-NC、anti-miR-3666轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞分組，用40 μmol/L 順阿曲庫銨處理，分為Cis+anti-miR-NC組和Cis+anti-miR-3666組。

1.3MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率 將細(xì)胞培養(yǎng)24 h，在每孔中加入20 μl的MTT并孵育4 h，再在每孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，然后用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度(OD)值，最后得出細(xì)胞增殖抑制率。

1.4Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

1.4.1遷移實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞調(diào)整密度為5×105個(gè)/ml，上室加100 μl懸浮液，下室加600 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，采用多聚甲醛固定30 min后，使用結(jié)晶紫進(jìn)行30 min染色，然后用倒置顯微鏡拍照和觀察，最后計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.4.2侵襲實(shí)驗(yàn)方法 T小室的上室加入適量基質(zhì)膠，按上述方法操作，最后計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.5Western印跡檢測蛋白表達(dá)方式 首先收集細(xì)胞提取總蛋白并定量煮沸變性。其次行電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，加一抗4℃孵育過夜。最后加入二抗室溫孵育2 h，使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，成像后檢測蛋白條帶的灰度值。

1.6RT-qPCR檢測miR-3666表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，并以U6為內(nèi)參行PCR擴(kuò)增，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。miR-3666上游引物5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游5′-CAGTGCAAGTGTAGATGCCGA-3′；U6上游引物5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游5′-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1順阿曲庫銨對膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響 與Con組比較，Cis-L、M、H組細(xì)胞增殖抑制率、p21表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 各組增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 順阿曲庫銨對膀胱癌T24細(xì)胞增殖及CyclinD1、p21蛋白表達(dá)的影響

2.2順阿曲庫銨對膀胱癌T24細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與Con組比較，Ois-L、M、H組細(xì)胞遷移、侵襲、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

表2 順阿曲庫銨對膀胱癌T24細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.3順阿曲庫銨對膀胱癌T24細(xì)胞中miR-3666表達(dá)的影響 與Con組(1.00±0.06)比較，Cis-L、M、H組miR-3666表達(dá)水平顯著升高(1.64±0.18、2.25±0.24、3.07±0.21；F=203.625，P<0.001)。

2.4過表達(dá)miR-3666對膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-3666組miR-3666表達(dá)水平、細(xì)胞增殖抑制率、p21表達(dá)水平均顯著高于miR-NC組，miR-3666組細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 miR-3666過表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.5抑制miR-3666表達(dá)逆轉(zhuǎn)順阿曲庫銨(40 μmol/L)對膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與Cis+anti-miR-NC組比較，Cis+anti-miR-3666組miR-3666表達(dá)水平、細(xì)胞增殖抑制率、p21表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表4，圖4。

表4 抑制miR-3666表達(dá)逆轉(zhuǎn)了順阿曲庫銨對膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

1，2：Cis+anti-miR-NC組，Cis+anti-miR-3666組

3 討 論

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤，且其復(fù)發(fā)率及死亡率也較高〔13,14〕。研究顯示，順阿曲庫銨抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔15〕。順式阿曲庫胺可抑制肺癌細(xì)胞A549和肝癌HepG2細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)凋亡〔16〕。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度順式阿曲庫胺處理膀胱癌細(xì)胞T24，結(jié)果顯示，順式阿曲庫胺可劑量依賴性的抑制膀胱癌細(xì)胞T24增殖、遷移和侵襲。且順式阿曲庫胺降低了CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平，提高了p21表達(dá)水平。CyclinD1、p21是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其異常表達(dá)可影響細(xì)胞增殖〔17,18〕。MMP-2、MMP-9通過降低細(xì)胞外基質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲〔19〕。本研究結(jié)果表明，順式阿曲庫胺抑制膀胱癌細(xì)胞T24增殖、遷移和侵襲的作用可能與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

miRNA是一類小的非編碼RNA， miRNA在調(diào)節(jié)癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因中具有重要作用〔20〕。已有研究報(bào)道m(xù)iR-3666參與調(diào)控多種腫瘤的惡性生物學(xué)行為，如宮頸癌組織中miR-3666水平顯著降低，垂體瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG)1調(diào)控miR-3666介導(dǎo)的鋅指結(jié)構(gòu)E-box結(jié)合蛋白(ZEB)1可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力〔21〕。miR-3666通過靶向賴氨酸脫甲基酶(KDM)2A抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長和遷移〔22〕。miR-3666過表達(dá)顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞的生長〔23〕。miR-3666過表達(dá)通過靶向沉默寡糖蛋白(SIRT)7抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔24〕。miR-3666還可通過靶向SIRT7促進(jìn)促凋亡信號通路進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長〔25〕。以上研究表明miR-3666可通過靶向調(diào)控其靶基因影響多種腫瘤的進(jìn)展。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-3666過表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞T24增殖、遷移和侵襲，miR-3666在膀胱癌中的作用與在其他癌癥中作用相似。

本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的順式阿曲庫胺處理膀胱癌細(xì)胞T24后，miR-3666表達(dá)水平呈劑量依賴性升高。將miR-3666抑制劑轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞后用順式阿曲庫胺處理，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖抑制率降低，細(xì)胞遷移、侵襲升高。表明抑制miR-3666表達(dá)逆轉(zhuǎn)了順阿曲庫銨對膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。