白天泉，姚俊杰，毛茜，王禮節(jié)，羅永泉

（1.貴州大學(xué)漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生態(tài)漁業(yè)有限責(zé)任公司，貴州 貴陽 550081）

魚類標(biāo)記技術(shù)是評估江、河、湖等水域開展人工增殖放流效果的重要手段之一，通過標(biāo)記—回捕法可研究魚類的生活史、生長發(fā)育以及漁業(yè)資源評估等。熒光標(biāo)記法具有操作簡單、節(jié)約成本、標(biāo)記效果好、適用于大規(guī)模放流等特點[1]。在鳙Aristichthys nobilis、斑馬魚Danio rerio、鰱Hypophthalmichthys molitrix、大馬哈魚Oncorhynchus keta、滇池金線鲃Sinocyclocheilus grahami 等魚類標(biāo)記的應(yīng)用中效果顯著，浸泡后80～90 d 在普通顯微鏡下檢測到標(biāo)記色，且在其他不可見光下標(biāo)記區(qū)能長久保持[2-7]。因此在增殖放流和漁業(yè)的相關(guān)研究中得到越來越多的支持和應(yīng)用[8]。

在熒光標(biāo)記的研究中，相對于其他熒光物質(zhì)標(biāo)記，茜素紅S（ARS）標(biāo)記大多應(yīng)用在魚類的早期發(fā)育中，且不同魚類對化學(xué)染料的耐受閾值不同，在50～500 mg/L 濃度下標(biāo)記效果良好[2,5,7,9]。ARS 屬于外源物質(zhì)，在外源物質(zhì)的脅迫下可能會造成機體氧化損傷甚至死亡，影響魚類生長發(fā)育、存活及生理響應(yīng)等。目前的研究大多集中在標(biāo)記效果和持久度[10-12]，而ARS 標(biāo)記對幼魚抗氧化系統(tǒng)影響的相關(guān)報道僅見于中華倒刺鲃Spinibarbus sinens 的研究[13,14]，對鱸鯉幼魚抗氧化指標(biāo)的影響研究未見報道。

鱸鯉Percocypris pingi 隸屬于鯉形目Cypriniformes、鯉科Cyprinidae，在雅礱江下游野生鱸鯉群體呈現(xiàn)低齡化和小型化發(fā)展[15]，被列為瀕危魚類[16,17]。本文通過研究不同濃度ARS 浸泡對鱸鯉幼魚抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）酶性和丙二醛（MDA）含量的影響，以期掌握熒光染色標(biāo)記的適宜濃度，并為科學(xué)地開展鱸鯉幼魚標(biāo)記放流提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鱸鯉幼魚采集自貴州省畢節(jié)市鑫有農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限責(zé)任公司雙坪基地，置于50 cm×60 cm×100 cm 養(yǎng)殖箱中。馴養(yǎng)期間正常投喂飼料；馴養(yǎng)7 d后挑選體質(zhì)健壯、活動力強、規(guī)格均勻的個體用于實驗。實驗所用試劑ARS（C14H7NaO7S）為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），分子量342.26；SOD、CAT、CSH-Px 和MDA 測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。

將ARS 配成1 000 mg/L 的母液，用于后續(xù)實驗。預(yù)實驗和正式實驗在19 cm×13 cm×9 cm 塑料箱中進行。預(yù)實驗分為6 個組、正式實驗分為7 個組，每個組設(shè)置3 個重復(fù)，實驗用水為曝氣24 h 后的自來水。實驗期間，充氧機充分曝氣，正常投喂飼料，早上、下午各投喂一次，每隔1 d 換一次水，每次換水量不超過整個養(yǎng)殖水體的2/3。測得pH（8.3±0.2），水體溫度（14±0.5）℃，溶氧量（8.3±0.1）mg/L，氨氮＜0.2 mg/L。在正式實驗之前，饑餓24 h，隨機取20 尾鱸鯉幼魚測其體長（5.89±0.62）cm、體質(zhì)量（1.48±0.39）g。

1.2 實驗方法

預(yù)實驗以0 mg/L 作為對照組，根據(jù)等對數(shù)間距系列設(shè)置濃度梯度為180 mg/L、240 mg/L、320 mg/L、420 mg/L、560 mg/L、750 mg/L 和1 000 mg/L。每個濃度組投放鱸鯉幼魚20 尾，觀察24 h，確定導(dǎo)致鱸鯉幼魚100%死亡的ARS 最小濃度和不引起死亡的ARS 最大濃度。結(jié)果顯示，1 000 mg/L 質(zhì)量濃度組的鱸鯉幼魚死亡率為100%，0 mg/L、180 mg/L、240 mg/L 質(zhì)量濃度組的死亡率為0%，320 mg/L、420 mg/L、560 mg/L、750 mg/L 濃度組的死亡率分別為5%、15%、40%、70%，通過直線內(nèi)插法計算出24 h半致死濃度（LC50）為623.335 mg/L。

在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，正式實驗在0 mg/L 對照組和最大耐受濃度組之間按等差數(shù)列設(shè)置了7 個濃度組，分別為0 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L、200 mg/L、240 mg/L，同時浸泡24 h。每個濃度組設(shè)置3 個重復(fù)，每組投放20 尾鱸鯉幼魚，共投放420 尾，浸泡24 h（0 d 暫養(yǎng)）后取一次，隨后將剩下的鱸鯉幼魚轉(zhuǎn)入盛有清水的收納箱中暫養(yǎng)，分別在暫養(yǎng)5 d 和10 d 后再取一次樣。取樣時在各濃度組中分別隨機取出3 尾鱸鯉幼魚，使用濃度為200 mg/L 的MS-222 麻醉后，迅速取出鱸鯉幼魚肌肉放入10 mL 離心管中，置于-20℃冰箱保存，用于測定不同濃度ARS 組鱸鯉幼魚肌肉中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量。鱸鯉幼魚都于取樣后投喂人工飼料，整個實驗用時11 d，其余條件與馴養(yǎng)條件一致。

組織勻漿液制備及酶活性測定使用預(yù)冷的生理鹽水漂洗鱸鯉幼魚肌肉組織，再用濾紙吸掉肌肉表面的水分，稱取適量的樣品，按照質(zhì)量∶體積=1∶9 加入4℃預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴條件下進行勻漿。勻漿液用冷凍離心機在4℃條件下2 000 r/min 下離心10 min，取上清液4℃保存待用。

樣品總蛋白含量、SOD、CAT、GSH-Px、MDA 含量的測定按照試劑盒說明書操作。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

所測數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD），通過SPSS 26 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan 多重比較（0.01＜P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著），采用GraPhPad Prism8 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱸鯉幼魚肌肉SOD 酶活性變化

不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉SOD 活性變化見圖1。由圖1 可知：ARS 浸泡鱸鯉幼魚24 h（暫養(yǎng)0 d），40 mg/L 濃度組肌肉SOD 活性（38.21±1.62）U 開始被誘導(dǎo)，但是，與對照組（36.66±1.65）U 差異不顯著（P＞0.05），從80 mg/L 濃度組（40.55±1.15）U 開始，SOD 活性顯著升高（P＜0.05），120～200 mg/L濃度組極顯著升高至（43.44±1.12）U、（42.25±1.43）U、（46.22±1.91）U（P＜0.01），200 mg/L濃度組的SOD 活性達到最大，而當(dāng)ARS 濃度到達240 mg/L（32.87±0.94）U 時受到抑制，SOD 活性急速下降，顯著低于對照組水平（P＜0.05）；在ARS 浸泡后第5 d，40 mg/L、160 mg/L 與對照組（35.57±1.24）U 差異不顯著（P＞0.05），除了在80 mg/L 濃度組被顯著誘導(dǎo)上升（38.98±1.61）U（P＜0.05）外，160～240 mg/L 濃度組被顯著抑制（P＜0.05）。浸泡標(biāo)記后第10 d，除了160 mg/L（37.97±1.11）U 和200 mg/L（33.16±0.68）U 濃度組，分別被顯著誘導(dǎo)和抑制外（P＜0.05），其他濃度組已恢復(fù)至對照組（35.82±1.02）水平（P＞0.05）。

圖1 不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉SOD 活性變化Fig.1 Changes in SOD activity in the muscles of Percocypris pingi juveniles soaked in ARS solution at different concentrations

2.2 鱸鯉幼魚肌肉CAT 酶活性變化

不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉中CAT活性變化見圖2。由圖2 可知：ARS 浸泡鱸鯉幼魚24 h 后（0 d）肌肉CAT 活性與SOD 活性變化一致，隨濃度梯度升高呈先上升后下降，在160～200 mg/L ARS 處理后CAT 活性相比對照組（14.52±0.62）U呈極顯著上升（P＜0.01），其他濃度組與對照組無顯著差異（P＞0.05）；ARS 浸泡后第5 d，40 mg/L 濃度組CAT 活性顯著低于對照組（14.37±1.75）U（P＜0.05），隨之逐漸上升，到120 mg/L 濃度組（21.81±0.81）U 時達到最大值（P＜0.01），160～240 mg/L 濃度組時急劇下降，顯著低于對照組（P＜0.05）；暫養(yǎng)10 d后，低濃度組基本恢復(fù)到正常水平，與對照組（15.33±1.90）U 差異不顯著（P＞0.05），而高濃度組中CAT 活性在160 mg/L（20.03±1.18）U 顯著升高（P＜0.05），隨著ARS 濃度的不斷加大，到200 mg/L（9.35±0.96）U（P＜0.01）和240 mg/L（10.42±1.04）U（P＜0.05）濃度組CAT 酶活性被抑制，顯著低于對照水平。

圖2 不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉CAT 活性變化Fig.2 Changes in CAT activity in the muscles of Percocypris pingi juveniles soaked in ARS solution at different concentrations

2.3 鱸鯉幼魚肌肉GSH-Px 酶活性變化

不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉中GSH-Px 活性變化見圖3。由圖3 可知：各濃度組ARS 浸泡鱸鯉幼魚24 h（暫養(yǎng)0 d）后，肌肉中GSH-Px 活性呈波浪式變化，整體呈現(xiàn)誘導(dǎo)作用，GSH-Px 活性高于對照組（42.23±1.47）U，40 mg/L、120 mg/L、200 mg/L 濃度組（P＜0.01）極顯著上升，80 mg/L、160 mg/L、240 mg/L濃度組顯著升高（P＜0.05）；暫養(yǎng)5 d 后，80 mg/L 濃度組顯著升高于對照組（39.21±1.28）U（P＜0.05），160～240 mg/L 濃度組極顯著低于對照水平；經(jīng)過10 d 的暫養(yǎng)后，40～120 mg/L 濃度組恢復(fù)到對照組水平（35.28±0.89）U（P＞0.05），160～240 mg/L 濃度組GSH-Px 活性持續(xù)被消耗，極顯著低于對照水平（P＜0.01），表現(xiàn)抑制作用。

圖3 不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉GSH-Px 活性變化Fig.3 Changes in GSH-Px activity in the muscles of Percocypris pingi juveniles soaked in ARS solution at different concentrations

2.4 鱸鯉幼魚肌肉MDA 含量變化

不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚MDA 含量變化見圖4。由圖4 可知：浸泡24 h（0 d）后，鱸鯉幼魚肌肉MDA 含量呈先降低后上升的趨勢，40～120 mg/L 濃度組顯著低于對照組（1.36±0.13）nmol/mg（P＜0.05），之后持續(xù)升高，從160～240 mg/L 濃度組顯著高于對照組（P＜0.05）。值得注意的是，當(dāng)ARS濃度加到200 mg/L 后MDA 活性達最大值[（2.02±0.12）nmol/mg]（P＜0.01）；ARS 浸泡后第5 d，120～240 mg/L 濃度組MDA 含量急劇下降，顯著低于對照組[（0.79±0.11）nmol/mg]（P＜0.05），而40 mg/L 和80 mg/L 濃度組已恢復(fù)到正常水平（P＞0.05）；ARS 浸泡后的第10 d，除了160 mg/L 濃度組和200 mg/L 濃度組顯著高于對照組之外（0.64±0.10）nmol/mg（P＜0.05），其余濃度組MDA 含量雖然有波動，但是均與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉MDA 含量變化Fig.4 Changes in MDA content in the muscles of Percocypris pingi juveniles soaked in ARS solution at different concentrations

3 討論

3.1 茜素紅S 對鱸鯉幼魚肌肉抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是魚體內(nèi)重要的抗氧化指標(biāo)[18,19]，三者共同協(xié)作，聯(lián)合清除魚體內(nèi)的氧自由基（ROS）[20]，降低氧化應(yīng)激損傷。一般認為，SOD是抵御氧自由基的第一道防線，最先與氧自由基作用。它的主要功能是清除魚體內(nèi)的超氧陰離子（O2-·），分解成分子氧和過氧化氫（H2O2），H2O2在CAT 和GSH-Px 的作用下分解成H2O 和O2，因此這些酶能夠清除氧自由基，保護細胞不受氧自由基損傷[21,22]。

ARS 浸泡鱸鯉幼魚24 h（ARS 浸泡后0 d），引起機體應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過量ROS，鱸鯉的代謝隨濃度的增加逐步加強，本研究中SOD 和CAT 酶活性變化具有相關(guān)性，都表現(xiàn)出拋物線型劑量效應(yīng)，即低濃度促進高濃度抑制。在低濃度組時，SOD 升高，分解過多的O2-·產(chǎn)生大量的H2O2，刺激CAT 活性也相應(yīng)的升高，加速分解H2O2，此時SOD、CAT 活性被誘導(dǎo)升高，但是在200 mg/L 濃度組時，超過它們的調(diào)節(jié)閾值，體內(nèi)大量的氧自由基積累，發(fā)生氧化損傷，隨后SOD 和CAT 活性開始下降，CAT 活性顯著低于對照組，表明此時鱸鯉肌肉受到了毒性影響，大量的自由基抑制了SOD 和CAT 的合成或被消耗。這與尖紫蛤Sanguinolaria acuta、斑馬魚、中華倒刺鲃的研究一致[14,23,24]，且都出現(xiàn)了“劑量效應(yīng)”，ARS 浸泡后第5 d，低濃度組SOD、CAT 和GSH-Px活性開始恢復(fù)，第10 d 時低濃度組恢復(fù)到正常水平，但是160～240 mg/L 濃度組酶活性依舊低于對照水平，說明SOD 與CAT 持續(xù)被消耗，體內(nèi)仍舊存在ROS，經(jīng)過10 d 暫養(yǎng)也沒能恢復(fù)到正常水平。

GSH-Px 和CAT 是分解H2O2的重要酶。GSH-Px 可被H2O2氧化生成H2O，將還原性谷胱甘肽（GSH）變成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。值得注意的是，在遇到外源物質(zhì)刺激脅迫時鱸鯉幼魚GSH-Px首先響應(yīng)，這與郭鶴等[3]的研究不同，不同魚類的不同器官中抗氧化酶活性調(diào)節(jié)閾值不同，其原因可能是鱸鯉肌肉中GSH-Px 與CAT 和SOD 的響應(yīng)模式不同，整個過程處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。這也可能是與CAT 存在競爭，肌肉中不同抗氧化酶作用的階段不同，此過程需要進一步研究。

3.2 茜素紅S 對鱸鯉幼魚肌肉MDA 的影響

MDA 是活性氧自由基攻擊生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物[25]，也可以與蛋白質(zhì)的游離氨基酸作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，導(dǎo)致細胞損傷[26]。MDA 的含量可以用來衡量氧化損傷的程度[27]。

霍來江[13]使用ARS 浸泡中華倒刺鲃24 h 后，腦中MDA 含量隨濃度梯度先減少后上升。潘建雄使用茜素絡(luò)合物浸泡鳙48 h 后第15 d，肌肉中MDA 含量隨濃度梯度先降低后升高，且都低于對照組[6]，在段必成[4]的研究中也有類似“低抑高促”的現(xiàn)象，這與本研究結(jié)果一致。ARS 浸泡24 h 后，鱸鯉肌肉中MDA 含量呈先下降低于對照水平后逐漸上升。在小于200 mg/L 濃度組中雖然MDA 含量在不斷升高，損傷程度也在不斷加深，但是，SOD、CAT、GSH-Px 的活力總體也同時呈上升趨勢，說明抗氧化酶活性足夠彌補ARS 脅迫下產(chǎn)生的氧化損傷。這與鎘對尖紫蛤抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化的研究結(jié)果一致[23]。與低鹽度脅迫對鯔Mugil cephalus 幼魚肌肉MDA 含量的研究也一致[28]。在200 mg/L 濃度組達到最大值，說明鱸鯉肌肉抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)達到閾值，已造成毒害作用。

小于120 mg/L 組ARS 浸泡后5～10 d，MDA 基本恢復(fù)，但是，在第5 d 160～240 mg/L 濃度組MDA含量仍顯著低于對照水平，同時SOD、CAT 和GSH-Px 活性也被抑制低于對照組，說明高濃度組中產(chǎn)生的抗氧化酶持續(xù)被消耗，在不斷地修復(fù)機體所受到的氧化損傷。到第10d 時，160mg/L和240mg/L濃度組MDA 含量高于對照組，同時，SOD、CAT、GSH-Px 活性受到不同程度的抑制并且低于對照水平，是因為高濃度ARS 脅迫下，鱸鯉幼魚肌肉產(chǎn)生的氧自由基超過了抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)的范圍，顯著抑制了CAT 和GSH-Px 等抗氧化酶活性，說明暫養(yǎng)10 d 后高濃度組ARS 對鱸鯉肌肉造成不可逆的損傷。

3.3 茜素紅S 浸泡鱸鯉幼魚的合理濃度

本實驗結(jié)果表明，浸泡后第10 d，40～120 mg/L濃度組SOD、CAT、GSH-Px 酶活力基本能恢復(fù)到正常水平，160 mg/L 濃度組時CAT、GSH-Px 活力和MDA 含量出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，前者開始下降，后者上升。根據(jù)抗氧化酶耐受最低閾值原則以及丙二醛含量變化情況，40～160 mg/L 間的ARS 對鱸鯉幼魚抗氧化指標(biāo)的影響較小。結(jié)合趙亞鵬等[7]的研究，使用ARS對滇池金線鲃浸泡24 h 時150 mg/L 的ARS 溶液熒光標(biāo)記效果良好。因此，4.27～6.51 cm 規(guī)格的鱸鯉幼魚推薦使用100～150 mg/L濃度的ARS進行標(biāo)記。