張龍，劉云鋒，曲克明，胡光春，陳世波，朱建新

（1.全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)，北京 100125；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3.安徽長(zhǎng)江漁業(yè)漁歌股份有限公司，安徽 蕪湖 241000；4.青島卓越海洋集團(tuán)有限公司，山東 青島 266400）

墨瑞鱈（Macculochella peelii）又名鱈鱸、澳洲龍紋斑、蟲紋鱈鱸或蟲紋石斑，屬于鱸形目、鱸科、鱈鱸屬，原產(chǎn)于澳大利亞?wèn)|南部莫瑞河流域。墨瑞鱈不但肉質(zhì)細(xì)膩、味道鮮美、少刺，而且魚體富含蛋白質(zhì)和DHA、EPA 等不飽和脂肪酸等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。墨瑞鱈自1999 年引進(jìn)中國(guó)臺(tái)灣馴養(yǎng)，此后在大陸有多家企業(yè)進(jìn)行苗種繁育和養(yǎng)殖，如青島七好科技股份有限公司、江蘇中洋集團(tuán)股份有限公司、浙江港龍漁業(yè)股份有限公司等。通過(guò)養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐證明：墨瑞鱈具有生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、餌料轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)。目前，墨瑞鱈在中國(guó)的養(yǎng)殖模式主要有池塘養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖兩種。其中，范慧慧等[1]（2019）開展了池塘內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖墨瑞鱈試驗(yàn)。李西雷等[2]和郭正龍等[3]則分別對(duì)墨瑞鱈工廠化苗種培育技術(shù)和墨瑞鱈工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖技術(shù)進(jìn)行了研究。但目前尚缺乏對(duì)墨瑞鱈工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖期間的生長(zhǎng)性能、養(yǎng)殖水體水質(zhì)變化以及生物濾池內(nèi)生物膜微生物多樣性的研究。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池底層和表層固定床生物填料表面生物膜微生物多樣性進(jìn)行檢測(cè)，以期為提升墨瑞鱈工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生物膜處理的效率提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)施與養(yǎng)殖生物

試驗(yàn)用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)主要是由8 個(gè)長(zhǎng)7.0 m、寬7.0 m、深1.1 m，有效養(yǎng)殖水體49 m3的養(yǎng)殖池和水處理系統(tǒng)組成，養(yǎng)殖池底均勻分布4 根長(zhǎng)度4 m、管徑2 cm 的納米充氣管，采用羅茨風(fēng)機(jī)和液氧進(jìn)行增氧，控制養(yǎng)殖期水體溶氧質(zhì)量濃度在6.0 mg/L 以上；養(yǎng)殖池上方棚頂設(shè)有采光口，光照度控制在1 000～1 500 Lx。水處理系統(tǒng)由轉(zhuǎn)鼓式微濾機(jī)（1.3 kW，南京雅億環(huán)境科技有限公司）、蛋白分離器（0.55 kW，青島海興智能裝備有限公司）、變頻式離心泵（5.5 kW，南通銀河水泵有限公司）、生物濾池（容積180 m3水體）、增氧池（陶瓷納米曝氣板，蘇州益品德環(huán)境科技有限公司）和紫外消毒器（2.5 kW，青島海興智能裝備有限公司）組成。采用三級(jí)生物濾池，一級(jí)位固定床生物濾池，填料為聚乙烯毛刷，二三級(jí)為移動(dòng)床生物濾池，填料為PVC 多孔環(huán)。養(yǎng)殖用水取自地下深井水，經(jīng)沉淀過(guò)濾處理后使用。墨瑞鱈苗種由安徽長(zhǎng)江漁業(yè)漁歌股份有限公司從澳大利亞進(jìn)口的仔魚培育成的大規(guī)格幼體，試驗(yàn)初期平均體質(zhì)量為36.20 g/尾。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)初期放養(yǎng)密度為200 尾/m3，在養(yǎng)殖過(guò)程中，墨瑞鱈投喂商品魚專用配合飼料，每天投喂兩次，分別為上午6:00 和下午18:00，日投喂量約占魚體總重的1.2%～1.5%，具體投喂量視魚類攝食和養(yǎng)殖水體水質(zhì)情況而定。日補(bǔ)水量10%左右，補(bǔ)充點(diǎn)設(shè)在泵池。平均規(guī)格在200 g/尾以下，日循環(huán)頻次控制在12 次/d 左右，平均規(guī)格大于200 g/尾時(shí)，日循環(huán)頻次提升至18 次/d。

每天定時(shí)采樣分析記錄水溫、溶氧、pH、鹽度、氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽指標(biāo)并記錄投喂量，記錄試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)試驗(yàn)用魚的體長(zhǎng)、體質(zhì)量等生物學(xué)指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)取采集固定床表層和底層生物填料樣品，對(duì)其微生物群落進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 分析方法

1.3.1 水質(zhì)分析

水溫、溶氧、pH 和鹽度采用YSI 水質(zhì)分析儀（OH，USA），NH4+-N 利用靛酚藍(lán)分光光度法、NO2--N利用鹽酸萘乙二胺分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 墨瑞鱈生長(zhǎng)性能參數(shù)

體長(zhǎng)、體質(zhì)量分別使用游標(biāo)卡尺、電子天平和電子稱測(cè)量，墨瑞鱈的特定增長(zhǎng)率（SGR，%/d）、存活率（SR，%）以及飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）計(jì)算公式如下：

特定增長(zhǎng)率（SGR，%/d）

存活率（SR，%）

飼料轉(zhuǎn)化率（FCR，%）

式中，W1—魚體終體質(zhì)量，g；W0—魚體初始體質(zhì)量，g；t—試驗(yàn)天數(shù)，d；S1—養(yǎng)殖開始魚體數(shù)量，尾；S0—養(yǎng)殖末期魚體數(shù)量，尾；Wf—飼料利用干重，kg；Wi—魚類增加總質(zhì)量，kg。

1.3.3 微生物高通量測(cè)序

使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取生物填料表面DNA，利用帶有Barcode 的特異性引物（515F 和806R）對(duì)提取的生物填料基因組DNA 的16S V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。在PCR 產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。若文庫(kù)合格，使用HiSeq 2500 PE250 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)在截取Barcode 和引物序列后，使用FLASH 1.2.7 軟件對(duì)樣品Reads 進(jìn)行拼接，得到原始數(shù)據(jù)（Raw Tags）[4]；利用Qiime 1.9.1 軟件對(duì)Raw Tags 進(jìn)行過(guò)濾處理，得到高質(zhì)量Tags 數(shù)據(jù)（Clean Tags）[5,6]；Clean Tags 序列通過(guò)（UCHIME Algorithm）與數(shù)據(jù)庫(kù)（Gold database）進(jìn)行比對(duì)[7]，去除其中的嵌合體序列[8]，得到有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。使用Uparse v7.0.1001 軟件將所有Effective Tags 聚類（97%）成為操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）[9]；通過(guò)Mothur 方法與SILVA 的SSUr-RNA 數(shù)據(jù)庫(kù)OTUs 對(duì)比進(jìn)行物種注釋[10,11]。通過(guò)香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）確定生物填料表面細(xì)菌生物多樣性。使用Origin.8 軟件對(duì)水樣細(xì)菌相對(duì)豐度（門和屬）進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)墨瑞鱈生長(zhǎng)性能

墨瑞鱈在循環(huán)水養(yǎng)殖過(guò)程中未出現(xiàn)疾病和大量死亡的狀況，生長(zhǎng)性能指標(biāo)見表1。經(jīng)過(guò)35 d 循環(huán)水養(yǎng)殖生產(chǎn)試驗(yàn)，墨瑞鱈體質(zhì)量由36.20 g 增長(zhǎng)至71.25 g，增重率為97.31%，初始放養(yǎng)密度由7.24 kg/m3增加至12.65 kg/m3，特定生長(zhǎng)率為1.93%/d，存活率和飼料轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到88.79%和73.61%。

表1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)墨瑞鱈生長(zhǎng)性能Tab.1 Performance parameters of Macculochella peeli in recirculating aquaculture system

2.2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖水體水質(zhì)變化

在墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖試驗(yàn)期間，養(yǎng)殖水體水溫在（28.0±1.0）℃，溶解氧始終控制在5.0 mg/L 以上，pH 隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，由試驗(yàn)初期7.71 降至試驗(yàn)?zāi)┢?.22（圖1）。

圖1 墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖水體pH 變化Fig.1 pH variations of aquaculture water in recirculating aquaculture system with Macculochella peeli during the experiment

在墨瑞鱈養(yǎng)殖試驗(yàn)過(guò)程中，養(yǎng)殖水體NH4+-N和NO2--N 質(zhì)量濃度變化如圖2 所示。其中，NH4+-N質(zhì)量濃度變化：在試驗(yàn)開始至第10 d，NH4+-N呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其質(zhì)量濃度升高至1.86 mg/L；第10～35 d，NH4+-N 變化趨于穩(wěn)定，其質(zhì)量濃度在0.70～1.86 mg/L 之間波動(dòng)。NO2--N質(zhì)量濃度變化：在試驗(yàn)開始至第10 d，NO2--N呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其質(zhì)量濃度升至0.52 mg/L；第10～11 d，NO2--N 有了一個(gè)急劇升高，其質(zhì)量濃度由0.52 mg/L 升至3.12 mg/L，這主要是由養(yǎng)殖生產(chǎn)中飼料投喂量增加所致；第11～13 d，NO2--N質(zhì)量濃度有一個(gè)快速下降的過(guò)程，自3.12 mg/L 降至0.90 mg/L，這主要是通過(guò)增加養(yǎng)殖水體換水量進(jìn)行調(diào)節(jié)的；第13～20 d，NO2--N質(zhì)量濃度在0.54～1.14 mg/L 間波動(dòng)；第20～23 d，NO2--N 質(zhì)量濃度再次呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)，最高升至5.00 mg/L；第23～28 d，NO2--N 呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，最低下降至1.20 mg/L；第28～35 d，NO2--N整體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，最低降至0.25 mg/L。

圖2 墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖水體中NH4+-N 和NO2--N 質(zhì)量濃度變化Fig.2 Variations of ammonia and nitrite concentrations of aquaculture water in recirculating aquaculture system with Macculochella peeli during the experiment

2.3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物膜微生物分析

2.3.1 微生物OTU 韋恩圖分析

圖3 為不同深度固定床生物填料微生物OTU韋恩圖。上層固定床生物填料OTU 較多，為2 088，其特異的OTU 數(shù)目為822，每個(gè)OTU 被認(rèn)為可代表一個(gè)細(xì)菌物種，說(shuō)明上層固定床生物填料表面微生物種類高于底層固定床生物填料表面微生物種類。

圖3 不同生物濾池深度固定床生物填料微生物OTU 韋恩圖Fig.3 Microorganism OTU venu diagram of the fixed bed biofill in different biofilter depth（A and B）

2.3.2 微生物豐度和多樣性分析

在群落生態(tài)學(xué)中，通過(guò)樣品的多樣性分析（Alpha 多樣性）可以反映微生物群落的豐度和多樣性。表2 中Alpha 多樣性指數(shù)主要包括計(jì)算群落豐度的ACE 和Chao1 兩個(gè)指數(shù)，以及計(jì)算群落多樣性的Shannon、Coverage 和Simpson 3 個(gè) 指 數(shù)。表2 中Coverage 值均在0.98 以上，數(shù)值較高，說(shuō)明樣品文庫(kù)覆蓋率高，數(shù)據(jù)可靠。根據(jù)測(cè)序公司提供的結(jié)論報(bào)告可得，Simpson 指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低；而Shannon 值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。在表2 中，上層固定床生物填料表面微生物Shannon 指數(shù)的變化范圍為4.08～4.17，平均值為4.12；底層固定床生物填料表面微生物Shannon 指數(shù)的變化范圍為4.06～4.27，平均值為4.16。底層固定床生物填料微生物Shannon 指數(shù)較高，說(shuō)明底層固定床生物填料表面微生物生物多樣性高于上層固定床生物填料表面微生物生物多樣性。同時(shí)，底層固定床生物填料表面Simpson 指數(shù)較小，與Shannon 指數(shù)表示結(jié)果一致。

表2 不同深度生物濾池固定床生物填料Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of the microbial Alpha diversity index in fixed bed biofill with different biofilter depth

圖4 為不同深度生物濾池固定床生物填料Shannon 指數(shù)箱式對(duì)比圖。底層固定床生物填料表面微生物Shannon 指數(shù)箱式圖的中位數(shù)和盒子位置均較高，即底層固定床生物填料表面微生物多樣性低于上層固定床生物填料表面微生物多樣性，結(jié)果與Shannon 指數(shù)結(jié)果一致。Chao1 指數(shù)反映微生物群落豐度，Chao1 數(shù)值越大，表示樣本物種豐度越大，上層固定床生物填料表面微生物Chao1 較小，說(shuō)明其物種豐度最小，ACE 指數(shù)反映的趨勢(shì)與Chao1 指數(shù)類似。

圖4 不同生物濾池深度固定床生物填料微生物Shannon指數(shù)箱式對(duì)比Fig.4 Comparison of Shannon index of total filter media in fixed bed biofill with different biofilter depth

2.3.3 功能微生物群落組成分析

圖5 為門水平下不同深度固定床生物填料微生物豐度圖。由圖5 可知，門水平上層固定床生物填料微生物主要包括：變形菌門（Proteobacteria）69.55%、疣微菌門（Verrucomicrobia）14.03%、浮霉菌門（Planctomycetes）6.07%；底層固定床生物填料微生物主要包括：變形菌門（Proteobacteria）59.43%、疣微菌門（Verrucomicrobia）21.04%、浮霉菌門（Planctomycetes）9.56%。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，變形菌門在二者之中均占大多數(shù)，為主要的優(yōu)勢(shì)菌門，但是上層固定床生物填料表面變形菌門占比較高，表明生物濾池上層環(huán)境更有利于變形菌門的生長(zhǎng)繁殖。

圖5 不同生物濾池深度固定床生物填料微生物在門水平下的群落結(jié)構(gòu)分布Fig.5 Community structure distribution of microbes of the fixed bed biofill under the phylum level in different biofilter depth

圖6 為綱水平下不同生物濾池深度固定床生物填料微生物群落結(jié)構(gòu)分布。由圖6 可知，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）40.82%、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）20.67%、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）13.76%在上層固定床生物填料微生物綱水平中占優(yōu)勢(shì)；γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）28.58%、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）27.73%、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）20.87%在底層固定床生物填料表面微生物綱水平中同樣占有優(yōu)勢(shì)。盡管生物濾池上層和底層固定床生物填料微生物優(yōu)勢(shì)菌綱相同，但是各個(gè)優(yōu)勢(shì)菌綱的相對(duì)豐度也有所差別。其中，上層固定床生物填料γ-變形菌綱相對(duì)豐度高于底層固定床生物填料γ-變形菌綱相對(duì)豐度，而α-變形菌綱和疣微菌綱則是相反，上層固定床生物填料疣微菌綱、α-變形菌綱的相對(duì)豐度高于底層固定床生物填料疣微菌綱、α-變形菌綱的相對(duì)豐度。

圖6 不同生物濾池深度固定床生物填料微生物在綱水平下的群落結(jié)構(gòu)分布Fig.6 Community structure distribution of microbes of the fixed bed biofill under the class level in different biofilter depth

圖7 為屬水平下不同生物濾池深度固定床生物填料微生物群落結(jié)構(gòu)分布。由圖7 可知，表層固定床生物填料在屬水平優(yōu)勢(shì)菌屬：不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）27.65%、黃 體菌屬（Luteolibacter）12.54%、羅氏桿菌屬（Rhodobacter）5.75%；底層固定床生物填料在屬水平優(yōu)勢(shì)菌屬：黃體菌屬（Luteolibacter）18.94%、氣單胞菌屬（Arenimonas）8.2%、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）6.76%、金黃色葡萄菌屬（Sandaracinobacter）6.47%。數(shù)據(jù)表明，不動(dòng)桿菌屬在固定床上層的相對(duì)豐度高于在底層的相對(duì)豐度，而黃體菌屬正好相反，在底層的相對(duì)豐度較高。

圖7 不同深度固定床生物填料微生物在屬水平下的群落結(jié)構(gòu)分布Fig.7 Community structure distribution of microbes of the fixed bed biofill under the genus level in different biofilter depth

表3 為不同生物濾池深度固定床生物填料硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度。由表3 可知，在上層固定床生物填料亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）的相對(duì)豐度分別為0.06%～0.11%、2.02%～2.40%；在底層固定床生物填料亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）的相對(duì)豐度分別為0.03%～0.06%、1.35%～2.23%。由上可知，亞硝化單胞菌屬在上層固定床生物填料相對(duì)豐度高于在底層生物填料相對(duì)豐度，而硝化螺旋菌屬在不同生物濾池深度固定床生物填料相對(duì)豐度差距不大。

表3 不同深度生物濾池固定床生物填料硝化細(xì)菌相對(duì)豐度/%Tab.3 Abundance of the nitrifying bacteria in fixed bed biofill with different biofilter depth

3 討論

3.1 在循環(huán)水養(yǎng)殖條件下墨瑞鱈的生長(zhǎng)性能

魚類養(yǎng)殖密度、生長(zhǎng)率和存活率是影響魚類最終收獲產(chǎn)量的直接因素，而魚類生長(zhǎng)存活又受光照、攝食、養(yǎng)殖水環(huán)境等諸多因素共同影響[12]。當(dāng)養(yǎng)殖水體惡化時(shí)，如氨氮和亞硝酸氮濃度過(guò)高，會(huì)對(duì)魚類的生長(zhǎng)存活造成負(fù)面影響，從而降低魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量[13]。為此，本研究選用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)，為魚類的快速生長(zhǎng)提供了保障。本研究表明：規(guī)格為36.2 g 墨瑞鱈經(jīng)過(guò)35 d 循環(huán)水養(yǎng)殖試驗(yàn)體質(zhì)量可以達(dá)到71.25 g，其增重率為97.31%，特定生長(zhǎng)率為1.93%/d，飼料轉(zhuǎn)化率為73.61%，存活率為88.79%。在墨瑞鱈工廠化養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中，規(guī)格為502 g 墨瑞鱈經(jīng)過(guò)6 個(gè)月養(yǎng)殖可生長(zhǎng)至1 596 g，特定生長(zhǎng)率為0.61%/d，飼料轉(zhuǎn)化率為57%，均低于本試驗(yàn)?zāi)瘅L的特定生長(zhǎng)率和飼料轉(zhuǎn)化率，這也許與放養(yǎng)密度、試驗(yàn)周期、飼料類型及管理方法不同有關(guān)[3]。本研究墨瑞鱈初始放養(yǎng)密度（7.24 kg/m3）較低，養(yǎng)殖周期較短（僅35 d）,養(yǎng)殖水體水質(zhì)較好，以上因素在一定程度上均有可能上促進(jìn)了墨瑞鱈的快速生長(zhǎng)。因此，在墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖過(guò)程中，選擇合適魚種放養(yǎng)密度和保持良好養(yǎng)殖水體水質(zhì)是保證魚類快速生長(zhǎng)和產(chǎn)量增收的關(guān)鍵。

3.2 在循環(huán)水養(yǎng)殖條件下墨瑞鱈養(yǎng)殖水體水質(zhì)變化

近年來(lái)，為滿足人們對(duì)健康水產(chǎn)品日益增加的需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)規(guī)模和集約化養(yǎng)殖程度不斷提升，使得單位養(yǎng)殖水體內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物放養(yǎng)密度和養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年提高。放養(yǎng)密度提高通常伴隨著人工配合飼料的大量投喂，造成養(yǎng)殖水體水質(zhì)惡化（溶解氧較低、氨氮和亞硝酸氮較高）速度加快，從而對(duì)養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)存活產(chǎn)生不利影響[14]。當(dāng)前，在魚類工廠化養(yǎng)殖過(guò)程中，養(yǎng)殖生產(chǎn)企業(yè)主要通過(guò)換水的方式改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)。這不僅僅造成養(yǎng)殖水資源極大浪費(fèi)，而且導(dǎo)致養(yǎng)殖周圍水域被污染。為此，本研究應(yīng)用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)，控制養(yǎng)殖水體pH、溶解氧、氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度。研究表明，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)通過(guò)將提高系統(tǒng)循環(huán)量（每天8～12 個(gè)循環(huán)）和高效增氧（液氧）相結(jié)合的方式使養(yǎng)殖水體溶解氧始終控制在6.0 mg/L以上，極大提高養(yǎng)殖水體溶氧使用效率。在試驗(yàn)過(guò)程中，pH 整體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，與史磊磊等[15]研究結(jié)果相一致。這主要是因?yàn)樵谘h(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池內(nèi)固定床彈性填料表面培養(yǎng)生物膜的過(guò)程中，在促進(jìn)養(yǎng)殖水體硝化反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)，有大量氫離子產(chǎn)物產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致系統(tǒng)運(yùn)行中養(yǎng)殖水體pH 下降。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)對(duì)養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)存活、呼吸代謝、生理生化、功能基因表達(dá)等方面造成負(fù)面影響[13,16-18]。在楊先明等[19]研究中，墨瑞鱈集約化養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度要求分別控制在2.9 mg/L和0.24 mg/L 以下；郭正龍等[3]研究表明，墨瑞鱈集約化養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度則是要求分別控制在1.93 mg/L 和0.019 mg/L 以下。然而，在本研究中，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度分別控制在1.86 mg/L 和5.00 mg/L 以下，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上述研究，這種試驗(yàn)結(jié)果的差異可能主要與生物膜培養(yǎng)方式、養(yǎng)殖水環(huán)境等因素不同有關(guān)[12]。本研究在墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖期間通過(guò)負(fù)荷掛膜的方式培養(yǎng)生物膜，節(jié)省了生物膜預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，降低了系統(tǒng)運(yùn)行成本，但在一定程度上也加大了養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸氮濃度急速升高的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)升高后下降的趨勢(shì)。其中，氨氮質(zhì)量濃度先上升，亞硝酸氮質(zhì)量濃度后上升，而氨氮質(zhì)量濃度下降較快，亞硝酸氮質(zhì)量濃度下降較慢。這也許表明循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)在生物膜培養(yǎng)過(guò)程中，養(yǎng)殖水體殘餌糞便經(jīng)氨化作用所形成的氨氮可以在硝化細(xì)菌的作用下快速轉(zhuǎn)換成亞硝酸氮，而亞硝酸氮轉(zhuǎn)化為硝酸氮?jiǎng)t需要相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間，即說(shuō)明亞硝酸氮氧化細(xì)菌生長(zhǎng)較慢,且亞硝化氮氧化細(xì)菌比氨氧化細(xì)菌更敏感[20]。在試驗(yàn)?zāi)硞€(gè)階段內(nèi)氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度出現(xiàn)較高的狀況，這主要是由于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物膜未培養(yǎng)成熟，養(yǎng)殖水體的硝化反應(yīng)不能完全進(jìn)行，從而導(dǎo)致了氨氮和亞硝酸氮的累積，這主要是由于硝化細(xì)菌是極為敏感的，易受到水體高氨氮和亞硝酸氮濃度、低溶解氧（＜0.1 mg/L）、pH 等因素抑制[21,22]。在生產(chǎn)實(shí)踐中面對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度較高的問(wèn)題，建議養(yǎng)殖生產(chǎn)者采用降低餌料投喂量、增加養(yǎng)殖水體換水量或系統(tǒng)循環(huán)量的方式減少養(yǎng)殖水體水質(zhì)變化對(duì)魚類生長(zhǎng)存活的影響。

3.3 不同生物濾池深度固定床生物填料微生物群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)分布

在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物處理是保證系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的重要組成環(huán)節(jié)，而生物濾池內(nèi)固定床生物填料快速掛膜是養(yǎng)殖廢水高效處理的關(guān)鍵。因此，探究生物濾池內(nèi)空間上生物膜微生物種類和生物多樣性對(duì)提高循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)利用效率和優(yōu)化循環(huán)水系統(tǒng)設(shè)計(jì)具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，生物濾池上層固定床生物填料生物膜群落多樣性高于底層固定床生物填料群落多樣性，這可能是由生物濾池底層溶解氧濃度較高，促進(jìn)好氧性細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所造成的。當(dāng)前，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物膜微生物主要可以分為異養(yǎng)細(xì)菌和自養(yǎng)細(xì)菌（主要是硝化細(xì)菌）兩類。有研究表明，異養(yǎng)細(xì)菌固氮效率是高于硝化細(xì)菌，這是因?yàn)楫愷B(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)率和生物量比硝化細(xì)菌的高10 倍，因而異養(yǎng)細(xì)菌在生物膜菌落組成中具有顯著優(yōu)勢(shì)[23]。在本研究中，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物膜微生物在門水平主要以變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）為優(yōu)勢(shì)菌門，其中變形菌門（Proteobacteria）占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度最高，與楊小麗等（2013）、藺凌云等（2017）相吻合[24,25]。在變形菌門中，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）在生物膜微生物群落中占有優(yōu)勢(shì)，相對(duì)分度分別為29.18%～45.78%和24.93%～29.11%。而在藺凌云等（2017）研究中，β-變形菌綱是生物填料表面相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌綱，這也許與水產(chǎn)養(yǎng)殖種類、養(yǎng)殖水環(huán)境和生物填料類型等因素不同有關(guān)[25,26]。γ-變形菌綱不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）在生物濾池上層固定床彈性填料上相對(duì)豐度最高，屬常見水體中的土著微生物，生長(zhǎng)于20～30℃好氧環(huán)境中，廣泛存在于土壤、水生環(huán)境以及魚類養(yǎng)殖廢水中，在淡水硝化反應(yīng)器和轉(zhuǎn)鼓式反硝化反應(yīng)器內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)，具有附著的性質(zhì)，有利于生物膜在生物填料表面的附著[27,28]。α-變形菌綱羅氏桿菌（Rhodobacter）在生物濾池上層固定床彈性填料上也具有較高的相對(duì)豐度，可生長(zhǎng)于淡水和海水中，在之前海水硝化反應(yīng)器和反硝化流化床反應(yīng)器研究中均有所發(fā)現(xiàn)[29]。疣微菌門（Verrucomicrobia）疣微菌綱（Verrucomicrobiae）黃體桿菌屬（Luteolibacter）在生物濾池底層固定床彈性填料上相對(duì)豐度最高，屬異養(yǎng)型反硝化細(xì)菌，廣泛存在于土壤和水生環(huán)境中，這也許表明生物濾池底層環(huán)境有利于促進(jìn)反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)[30]。γ-變形菌綱氣單孢菌屬（Arenimonas）在生物濾池底固定床彈性填料上也具有較高的相對(duì)豐度，可生長(zhǎng)于3～40℃不同鹽度的水生環(huán)境中，尤其廣泛存在于魚類養(yǎng)殖廢水中[31]。

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物處理的關(guān)鍵是生物濾池中生物膜的培養(yǎng)，即培養(yǎng)生物膜上的硝化細(xì)菌。按照硝化細(xì)菌的功能而言，可以將硝化細(xì)菌分為氨氧化細(xì)菌和亞硝酸氮氧化細(xì)菌。一般來(lái)說(shuō)，亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）、亞硝化球菌屬（Nitrosococcus）、亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira）是氨氧化細(xì)菌（AOB）中最常見的菌屬，而硝化螺旋菌屬（Nitrospira）和硝化桿菌屬（Nitrobacter）是亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（NOB）中最常見的菌屬。在本研究中，亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬在墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物填料上均被發(fā)現(xiàn)，在生物填料生物膜上亞硝化單胞菌屬、硝化螺旋菌屬的相對(duì)豐度為0.03%～0.11%和1.35%～2.71%。在Bartelme 等（2017）有關(guān)淡水硝化反應(yīng)器微生物群落的研究中，亞硝化單胞菌屬相對(duì)豐度＜1%,硝化螺旋菌屬相對(duì)豐度2%～5%，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致[32]。在Huang 等（2016）有關(guān)不同循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（海水）生物濾池細(xì)菌群落的基因組學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬在浸入式生物濾池相對(duì)豐度分別為0.1%～0.5%和1.6%～1.9%，其硝化螺旋菌屬的相對(duì)豐度與本試驗(yàn)結(jié)果相近[33]。綜上所述，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物膜上亞硝化單胞菌屬相對(duì)豐度一般低于硝化螺旋菌屬相對(duì)豐度，即氨氧化細(xì)菌相對(duì)豐度低于亞硝酸氮氧化細(xì)菌相對(duì)豐度。但二者相對(duì)豐度又要低于異養(yǎng)細(xì)菌的相對(duì)豐度，這主要與細(xì)菌的生長(zhǎng)類型有關(guān)，硝化細(xì)菌屬于自養(yǎng)類型，生長(zhǎng)速度較慢，且細(xì)菌的生物量較少[21]。雖然硝化細(xì)菌生物膜微生物群落中相對(duì)含量較低，但是在高效凈化養(yǎng)殖水體水質(zhì)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

3.4 結(jié)論

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的應(yīng)用不僅提高了墨瑞鱈的生長(zhǎng)性能（特定生長(zhǎng)率、飼料轉(zhuǎn)化率），而且改善了養(yǎng)殖水體水質(zhì)（溶解氧、氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度）。墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物膜在門水平的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、疣微菌門、浮霉菌門，在綱水平的優(yōu)勢(shì)菌綱為γ-變形菌綱、α-變形菌綱、疣微菌綱。墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)不同生物濾池深度生物膜屬水平優(yōu)勢(shì)菌屬有所不同，生物濾池上層生物膜優(yōu)勢(shì)菌屬是不動(dòng)桿菌屬、黃體菌屬、羅氏桿菌屬，生物濾池上層生物膜優(yōu)勢(shì)菌屬是黃體菌屬、氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、金黃色葡萄菌屬。墨瑞鱈循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物膜中硝化細(xì)菌為亞硝化單胞菌和硝化螺旋菌，其相對(duì)豐度分別為0.03%～0.11%和1.35%～2.71%。