陳佳闊，曹鑫艷，魏立翔，高之煜，孫延鳴，張彥兵

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000)

清道夫受體(scavenger receptors，SRs)是巨噬細(xì)胞識別、清除病原微生物的模式識別受體之一，根據(jù)其功能結(jié)構(gòu)特點分為8種不同的類別(A～H)。膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細(xì)胞受體(macrophage receptor with collagenous structure，MARCO)屬于A類清道夫受體(scavenger receptor class A，SRA)。Elomaa O等[1]首次從小鼠脾臟和淋巴結(jié)中克隆和鑒定了MARCO基因。研究表明，MARCO可以與多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分結(jié)合，例如細(xì)菌脂多糖、磷壁酸、乙?；兔芏戎鞍椎?，通過識別細(xì)菌細(xì)胞壁外表面等成分，能廣泛介導(dǎo)吞噬病原菌，在清除病原菌感染中發(fā)揮重要作用[2-3]。

MARCO在機體內(nèi)的表達(dá)分布存在嚴(yán)格的限制，僅在肺組織、脾臟、淋巴結(jié)中高水平表達(dá)[1-4]。令人疑惑的是，與SRA的表達(dá)分布相反，MARCO在肺泡巨噬細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。Xiang X等[5]已證實MARCO在豬體內(nèi)僅表達(dá)于肺組織、脾臟、淋巴結(jié)中，在豬肺泡巨噬細(xì)胞中MARCO蛋白基本不表達(dá)。綿羊MARCO基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平也存在組織特異性，綿羊MARCO高表達(dá)于肺組織，而在肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)量較低[6]。

啟動子能特異性識別和結(jié)合RNA聚合酶并使之活化，在真核生物基因起始轉(zhuǎn)錄過程中具有重要作用[7]。那么，綿羊MARCO在肺組織和肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的差異性是否與其啟動子特點相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。本研究通過克隆綿羊MARCO基因的啟動子區(qū)序列，利用生物信息學(xué)方法對該序列進(jìn)行預(yù)測和分析，并構(gòu)建綿羊MARCO啟動子熒光素酶報告基因重組載體，為將來進(jìn)一步研究綿羊MARCO基因的表達(dá)調(diào)控機理提供基本材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒 大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，生工生物工程有限公司產(chǎn)品；pGL3-Basic質(zhì)粒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所邱亞峰研究員饋贈。

1.1.2 主要試劑 DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、T4 DNA連接酶、NheⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，TaKaRa公司產(chǎn)品；Hieff Canace?Gold High-Fidelity DNA Polymerase，翌圣生物科技(上海)股份有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 移液器、離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；ABI-2720 PCR擴增儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；Alpha紫外凝膠成像儀，美國ProteinSimple公司產(chǎn)品；PowerPac基礎(chǔ)型核酸電泳儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)基因數(shù)據(jù)庫中綿羊MARCO基因(Gene ID:101111074)的參考序列，以5′UTR上游序列約1 002 bp為參考，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)，由上海睿勉生物公司(上海)合成。

表1 引物序列

1.2.2 綿羊MARCO基因啟動子PCR擴增及鑒定 利用DNA提取試劑盒提取薩?？司d羊肺組織DNA作為模板，擴增MARCO基因啟動子，擴增反應(yīng)體系：ddH2O 18.5 μL，上、下游引物各2 μL，2×Canace?Gold PCR buffer(含Mg2+，dNTPs)25 μL，DNA模板2 μL，Hieff Canace?Gold High-Fidelity DNA Polymerase(2 U/μL)0.5 μL；PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收DNA純化試劑盒說明回收DNA并測序。

1.2.3 綿羊MARCO基因啟動子生物信息學(xué)分析 利用UCSC(https://genome.ucsc.edu/)數(shù)據(jù)庫和National Center for Biotechnology Information(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測綿羊MARCO基因啟動子序列；利用DNA Star Version7.1.0(44)軟件比對不同數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的MARCO基因啟動子序列；利用在線軟件Berkeley Drosophila Genome Project(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù)測啟動子可能的活性區(qū)域；利用AliBaba2.1軟件(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分析預(yù)測綿羊MARCO基因啟動子上潛在的轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子。

1.2.4 綿羊pGL3-MARCO載體構(gòu)建和鑒定 將測序確認(rèn)后的MARCO基因啟動子與pGL3-Basic載體連接。具體操作如下，首先用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ線性化pGL3-Basic載體，膠回收備用；連接體系：T4 DNA連接酶1 μL，線性化載體2 μL，純化的片段15 μL，10×buffer 2 μL，16 ℃水浴反應(yīng)過夜，連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。氨芐青霉素抗性平板篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆菌落、提取質(zhì)粒，酶切鑒定。鑒定后交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 綿羊MARCO基因啟動子擴增及鑒定

利用PCR成功擴增出綿羊MARCO基因啟動子序列，大小為1 002 bp，與預(yù)期大小相符(圖1)?？寺〉木d羊MARCO基因啟動子序列與GenBank中預(yù)測的綿羊MARCO基因啟動子序列一致，表明成功克隆綿羊MARCO基因啟動子序列。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.MARCO基因啟動子

2.2 綿羊MARCO基因啟動子生物信息學(xué)分析

2.2.1 啟動子活性區(qū)域預(yù)測 通過對啟動子活性區(qū)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)綿羊MARCO基因啟動子含有1個潛在的活性區(qū)域，啟動子序列上含有典型的TATA-box元件(圖2)，該元件在-14～-9。

圖2 綿羊MARCO基因啟動子及其活性區(qū)域預(yù)測

2.2.2 綿羊MARCO基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析 綿羊MARCO基因啟動子的激活需要與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。利用軟件AliBaba2.1對獲得的綿羊MARCO基因啟動子預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在多個轉(zhuǎn)錄因子作用元件，如GATA-1、GATA-3、Sp1、Oct-1、C/EBPalp、NF-1、NF-κB和c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。其中，出現(xiàn)頻率較高的有Sp1、NF-1、NF-κB、C/EBPalp轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(圖3)。

圖3 綿羊MARCO基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

2.3 綿羊MARCO基因啟動子熒光素酶報告載體構(gòu)建和鑒定

將構(gòu)建好的pGL3-MARCO熒光素酶報告質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后，出現(xiàn)線性化的pGL3-Basic載體條帶和綿羊MA-RCO基因啟動子條帶(圖4)，雙酶切驗證后將質(zhì)粒交由生物公司進(jìn)行測序，測序獲得序列與預(yù)測的一致，說明成功構(gòu)建了pGL3-MARCO熒光素酶報告質(zhì)粒，為后續(xù)進(jìn)行基因突變和雙熒光素酶活性測定等驗證試驗奠定了基礎(chǔ)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;1.重組質(zhì)粒pGL3-MARCO雙酶切

3 討論

MARCO作為一種A類清道夫受體，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌從而抵御病原菌的侵入[1,8-10]。豬源MARCO主要高表達(dá)于肺組織，綿羊MARCO基因轉(zhuǎn)錄水平與之類似[6]。然而，MARCO在綿羊肺組織高表達(dá)的機理不明。因此，本試驗利用生物信息學(xué)方法對克隆的綿羊MARCO基因啟動子的特性進(jìn)行預(yù)測和分析，為進(jìn)一步揭示綿羊體內(nèi)MARCO基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機理提供基礎(chǔ)材料。

本試驗克隆的綿羊MARCO基因啟動子序列，位于起始密碼子上游-1002/-1bp。TATA-box是構(gòu)成真核生物典型的核心啟動子元件之一，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用[11]。TATA結(jié)合蛋白(TATA-binding protein，TBP)識別啟動子區(qū)域TATA-box并結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ開始轉(zhuǎn)錄。一般認(rèn)為，組織特異性表達(dá)基因均具有TATA-box[12]。本試驗發(fā)現(xiàn)有1個典型的TATA-box元件，位于綿羊MARCO基因啟動子翻譯起始密碼子上游-14/-9bp，所以推測綿羊MARCO基因為組織特異性表達(dá)基因。

轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體從而參與轉(zhuǎn)錄起始過程，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在綿羊MARCO基因啟動子區(qū)預(yù)測到Sp1、NF-1、NF-κB等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。先前的研究已證實，人源Sp1可以結(jié)合Fbxl2(F-box and leucine rich repeat protein 2，F(xiàn)bxl2)基因啟動子激活其高水平表達(dá)[15]，Sp1還參與激活HIV-1 LTR(long terminal repeat，LTR)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[16]。因此，轉(zhuǎn)錄因子Sp1在結(jié)合促進(jìn)啟動子激活方面發(fā)揮重要作用。NF-1參與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，通過與CAAT-box結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)[17]。研究表明[18]轉(zhuǎn)錄因子NF-1具有正向調(diào)控山羊前黑素小體蛋白(premelanosome protein)基因轉(zhuǎn)錄活性的作用。由此可見，Sp1、NF-1 和NF-κB與MARCO基因的表達(dá)有潛在聯(lián)系。

本試驗成功克隆了綿羊MARCO基因啟動子，并對啟動子序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步構(gòu)建了綿羊MARCO基因啟動子熒光素酶報告基因載體。然而，綿羊MARCO基因啟動子是否具有啟動子活性、預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是否正確，需進(jìn)一步驗證和深入研究。