周沁陽(yáng)，趙景云

(1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.云南省中醫(yī)中藥研究院，云南 昆明 650223)

山豆根為豆科植物越南槐 Sophora Tonkinensis Gagnep(STG)的干燥根和根莖。2020年版《中國(guó)藥典》中記載山豆根性味苦，寒，有毒；具清熱解毒，消腫利咽之功，用于火毒蘊(yùn)結(jié)，乳蛾喉痹，咽喉腫痛，齒齦腫痛和口舌生瘡[1]。山豆根用藥歷史悠久，臨床運(yùn)用廣泛，具有較高藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)山豆根中化學(xué)成分主要包括生物堿、黃酮、多糖和三萜和芳香類(lèi)化合物等，具有抗乙肝和人免疫缺陷病毒、抗氧化、抗腫瘤、保肝、提高免疫力、降壓以及解痙止瀉等生物活性[2-3]。2020年版《中國(guó)藥典》以苦參堿(matrine)和氧化苦參堿(oxymatrine)作為其質(zhì)量控制指標(biāo)。

炎癥反應(yīng)(inflammation)是一系列損傷因子引起具有血管系統(tǒng)的活體組織產(chǎn)生主動(dòng)性的防御，多種疾病的發(fā)病與此有關(guān)[4]。炎癥反應(yīng)是很多疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性腦卒中和炎癥性腸病等的病理基礎(chǔ)[5-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，大部分苦參堿型生物堿具有明顯鎮(zhèn)痛抗炎活性，其中鎮(zhèn)痛作用較強(qiáng)的為苦參堿和槐定堿，對(duì)耳腫脹抑制作用較強(qiáng)的為槐果堿、氧化苦參堿和鷹爪豆堿[7]。觀察山豆根顆粒及其飲片對(duì)LPS小鼠急性炎癥模型，小鼠血清NOS、NO、MDA、TNF-α和IL-6等含量的影響，提示山豆根顆粒及其飲片各劑量均能顯著抑制小鼠足腫脹度[8]。山豆根水提組分對(duì)混合致炎液所致咽喉實(shí)熱證模型小鼠耳腫脹具有較強(qiáng)抑制作用[9]。山豆根藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，其水提物能以劑量依賴(lài)性，對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型發(fā)揮抗炎作用，且藥效與體內(nèi)苦參堿系統(tǒng)暴露量成正相關(guān)[10]。山豆根主要成分之一槐果堿能夠抑制LPS介導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與干預(yù)NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿氯化鈉注射液能夠有效緩解新型冠狀病毒肺炎(doro-navirus disease 2019，COVID-19)模型小鼠的肺部損傷，降低其肺組織中病毒核酸載量和相關(guān)炎癥介質(zhì)水平，提高外周血淋巴細(xì)胞比例[12]。以上文獻(xiàn)回顧提示，山豆根及其效用成分具有良好的抗炎作用。

針對(duì)中藥具有多成分，作用多靶點(diǎn)以及多通路的特點(diǎn)，近年來(lái)應(yīng)運(yùn)而生的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，旨在研究藥物、疾病、靶點(diǎn)和通路之間相互作用關(guān)系，研究建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，分析預(yù)測(cè)多種藥物成分在體內(nèi)的互作關(guān)系[13]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)藥物作用通路的多靶點(diǎn)與多途徑，與中藥治療疾病的原理相契合，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供了新思路。本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對(duì)山豆根抗炎活性成分以及潛在靶點(diǎn)進(jìn)行研究探討，為進(jìn)一步詮釋其可能的抗炎作用機(jī)制，促進(jìn)臨床合理用藥以及相關(guān)藥物研發(fā)等拓展新思路，并提供相應(yīng)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 化合物數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem(https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；整合型生物信息及疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards(https：//www.genecards.org/)；疾病靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot(https：//www.uniprot.org/)；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)；藥效團(tuán)匹配與潛在識(shí)別靶標(biāo)平臺(tái)PharmMapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)；蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)String(https：//string-db.org/)；富集分析數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)；R語(yǔ)言4.1.2軟件；Cytoscape 3.8.0軟件。

1.2 藥物相關(guān)抗炎活性成分及藥物靶點(diǎn)篩選 在TCMSP搜索引擎中輸入“山豆根”進(jìn)行檢索得到目標(biāo)化合物信息，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%和類(lèi)藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18作為化合物篩選條件。在Pubchem中輸入對(duì)應(yīng)化合物的CAS號(hào)，下載其sdf格式文件。將對(duì)應(yīng)化合物的sdf格式文件導(dǎo)入PharmMapper網(wǎng)站，僅從人類(lèi)蛋白靶點(diǎn)數(shù)據(jù)中進(jìn)行匹配(Human Protein Targets Only)，得到化合物潛在靶點(diǎn)，下載數(shù)據(jù)文件備用。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選與靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以疾病名稱(chēng)“Inflammation”進(jìn)行檢索，得到炎癥疾病相關(guān)靶標(biāo)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)分別上傳得到的藥物潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)名稱(chēng)，蛋白種屬設(shè)置為智人“homo sapiens”，獲取其靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。將二者相互映射，得到山豆根抗炎活性成分潛在靶標(biāo)。

1.4 藥物靶蛋白—疾病靶蛋白網(wǎng)絡(luò)的建立與拓?fù)浞治?將篩選得到的共有靶標(biāo)上傳至String平臺(tái)，選擇“multiple proteins”，蛋白種屬及背景設(shè)為“homo sapiens”，以最高置信度位篩選條件“highest confidence(≥0.9)”進(jìn)行篩選，建立“藥物靶蛋白—疾病靶蛋白”(PPI)相互作用網(wǎng)絡(luò)，得到PPI相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)并下載備用。將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，使用內(nèi)置插件CytoNCA，Centralities項(xiàng)下除“degree”外全部選取并進(jìn)行拓?fù)浞治?，?dǎo)出分析結(jié)果，以點(diǎn)度中心性(Degree Centrality，DC)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)和中介中心性(Betweenness Centrality，BC)篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)的建立 以PPI結(jié)果篩選出的潛在靶點(diǎn)、活性成分建立屬性和網(wǎng)絡(luò)Excel表格文件以作對(duì)應(yīng)關(guān)系。將兩個(gè)文件導(dǎo)入Cytoscape3.80軟件，刪除未匹配的節(jié)點(diǎn)，以“度”值(degree)大小對(duì)各節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排序，以顏色深淺和大小注釋度值大小，顏色越深，節(jié)點(diǎn)大小越大，代表其與其它節(jié)點(diǎn)之間關(guān)聯(lián)越緊密，建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因富集和通路富集分析 將上述篩選出的PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”，“gene list”下選“homo sapiens”即進(jìn)行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析以及GO(Gene Ontology)生物富集分析，對(duì)其可能存在的生物過(guò)程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)進(jìn)行分析。下載數(shù)據(jù)文件，將相關(guān)性較高的結(jié)果使用R語(yǔ)言進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1 山豆根抗炎活性成分篩選 通過(guò)以“山豆根”為關(guān)鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)進(jìn)行檢索，OB ≥ 30%和DL≥0.18作為篩選條件，最終得到15個(gè)潛在活性成分，包括多種生物堿和黃酮類(lèi)等化合物，其信息見(jiàn)表1。

表1 山豆根抗炎活性成分基本信息

2.2 山豆根抗炎靶點(diǎn)篩選 通過(guò)PharmMapper網(wǎng)站得到15個(gè)化合物的潛在靶點(diǎn)基因，去除重復(fù)后共682個(gè)。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“Inflammation”進(jìn)行檢索，得到炎癥疾病靶標(biāo)共10945個(gè)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。將潛在活性成分與靶點(diǎn)相映射，得到山豆根活性成分抗炎潛在靶標(biāo)共416個(gè)(圖1)。

圖1 “疾病-藥物”共有靶點(diǎn)篩選

2.3 GO和KEGG分析及“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化 利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，將山豆根抗炎靶基因進(jìn)行上傳，并限定條件進(jìn)行GO及KEGG信號(hào)通路的富集分析。按P值排序，并篩選確定前10的BP、MF和CC(表2)，利用R語(yǔ)言進(jìn)行生物信息分析可視化(圖2)，以外圈顏色深淺代表?xiàng)l目置信度，以?xún)?nèi)圈柱形長(zhǎng)短代表富集程度。GO富集分析顯示，共同靶點(diǎn)主要涉及的生物學(xué)過(guò)程包括對(duì)凋亡的負(fù)調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)和對(duì)外源刺激的反應(yīng)等；主要分布于細(xì)胞質(zhì)、外泌體和細(xì)胞胞外等結(jié)構(gòu)中；主要涉及的分子功能過(guò)程包括識(shí)別蛋白質(zhì)的結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性和絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等(表2)。通過(guò)KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，以P進(jìn)行排序，山豆根抗炎活性成分涉及的通路可能主要包括Hif-1α、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路(圖3)。對(duì)篩選出的靶點(diǎn)、活性成分以及通路建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)。

圖2 GO富集分析主要條目

圖3 KEGG通路富集分析結(jié)果

圖4 “藥物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 GO富集分析主要條目

2.4 PPI與拓?fù)浞治鼋Y(jié)果 將共有靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，使用內(nèi)置的CytoNCA軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，以DC，CC和BC為拓?fù)鋵W(xué)指標(biāo)，各取其排序前10位的結(jié)果，取3種拓?fù)浞治龇绞焦灿械慕患蜃鳛樯蕉垢委熝装Y的核心靶點(diǎn)(圖5)，包括原癌基因非受體酪氨酸激酶SRC，絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、熱休克蛋白90α(heat shock protein 90 alpha，HSP90AA1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1和大腸桿菌堿性磷酸酶(E.coli Phosphatase Alkaline，PHOA)。

圖5 拓?fù)浞治鼋Y(jié)果通路富集分析結(jié)果

3 討論

山豆根始載于宋《開(kāi)寶本草》，“味甘，寒，無(wú)毒”；《本草求真》載其為“解咽喉腫痛第一要藥”[14]。最早的本草文獻(xiàn)記載“出廣南”，為廣西和云南的道地藥材，也是山豆根片(口服液)和抗病毒顆粒等40多種中成藥生產(chǎn)的主要原料。自1963年版《中國(guó)藥典》首載“廣豆根”以來(lái)，此后為歷版藥典收載。此外，山豆根也是喀斯特石漠化貧困山區(qū)脫貧致富重要的藥材資源之一。

臨床前研究和臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)山豆根具有良好的解熱抗炎作用，但其中主要的抗炎效用成分尚不完全明晰。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的山豆根抗炎活性成分和潛在靶點(diǎn)分析，共篩選到15個(gè)潛在抗炎活性成分，包括苦參堿、槐果堿和異鼠李素等成分，認(rèn)為是山豆根發(fā)揮抗炎效用的主要成分。這些成分主要參與到對(duì)凋亡的負(fù)調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)和對(duì)脂多糖的反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程中。通路富集結(jié)果顯示，HIF-1信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路、Ras信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路等被顯著富集。通過(guò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，山豆根抗炎活性成分可能主要作用于SRC、MAPK1和Akt1等主要靶點(diǎn)，發(fā)揮抗炎作用。

缺氧和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1是一種在缺氧狀態(tài)下特異性發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)，由α和β兩個(gè)亞單位組成的異源二聚體。HIF-1α(HIF1A)具有氧不穩(wěn)定性的特點(diǎn)。在正常細(xì)胞中，HIF-1α通過(guò)蛋白酶的脯氨酰羥化和泛素化降解，而缺氧會(huì)干擾泛素化過(guò)程而使HIF-1α得到積累，繼而HIF-1α遷移到核內(nèi)與HIF-1β結(jié)合，形成復(fù)合物啟動(dòng)下游包括經(jīng)典炎癥信號(hào)NF-κB在內(nèi)的基因通路表達(dá)。研究認(rèn)為在缺氧條件下巨噬細(xì)胞中的HIF-1α水平會(huì)升高，進(jìn)一步加劇巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[15]。過(guò)表達(dá)HIF-1α?xí)舆t炎癥反應(yīng)的消退，其機(jī)制可能與中性粒細(xì)胞凋亡被抑制有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，山豆根抗炎活性成分可能參與到HIF-1信號(hào)通路中發(fā)揮作用。

酪氨酸蛋白激酶Src，屬于受體型酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)家族成員，是一類(lèi)由多種細(xì)胞外信號(hào)分子激活的蛋白酪氨酸激酶，Src通過(guò)磷酸化修飾調(diào)控自身活性并向下傳遞信號(hào)。Src蛋白激酶是PI3K的活性激動(dòng)劑，在LPS刺激下，能通過(guò)PI3K信號(hào)通路增加p47phox活性，刺激NADPH氧化酶產(chǎn)生O2·-；并且抑制Src蛋白激酶磷酸化后，可拮抗LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少巨噬細(xì)胞炎癥因子合成和分泌[16-17]。既往研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素(STG1)能通過(guò)抑制Src的表達(dá)，從而起到緩解結(jié)腸炎的作用[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿(STG12)能通過(guò)靶向阻斷Src激酶結(jié)構(gòu)域中Tyr419的自磷酸化，抑制Src激酶活性，進(jìn)而下調(diào)MAPK/ERK信號(hào)通路的活化水平，從而抑制癌細(xì)胞的過(guò)度增殖[19]。MAPK信號(hào)通路中包含ERK、JUK和p38等MAPK亞族，MAPK在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。相關(guān)文獻(xiàn)回顧性研究提示，異鼠李素(STG1)能夠調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK等信號(hào)通路的激活，調(diào)控炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[21]?？鄥A(STG12)能夠誘導(dǎo)p38的磷酸化，促進(jìn)Nrf-2的入核，提高HO-1/NADPH的表達(dá)水平，在體內(nèi)和體外抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生并抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并且該效應(yīng)能被MAPK抑制劑所阻斷，提示苦參堿至少部分通過(guò)MAPK通路發(fā)揮抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用[22]。蛋白激酶B PKB也稱(chēng)Akt，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)3種Akt亞型(Akt1、Akt2和Akt3)，Akt1在心血管系統(tǒng)中調(diào)節(jié)多種功能，在血管生成、細(xì)胞凋亡和心肌肥大的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[23]。在ApoE-/-小鼠上，Akt1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化病變，包括血管狹窄，纖維帽變薄，更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)等[24]。槲皮素(STG15)能夠抑制TGF-β1/Smads和Akt信號(hào)激活，減弱肝星狀細(xì)胞活化，抑制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化從而減輕肝損傷[25]。

基于相關(guān)文獻(xiàn)回顧性研究提示和思考，結(jié)合本研究結(jié)果分析認(rèn)為，未來(lái)進(jìn)一步明確山豆根抗炎和其他藥理效用的關(guān)鍵，應(yīng)充分融合包括藥劑學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)等不同學(xué)科特點(diǎn)，辨析不同屬地山豆根的藥理活性與其中各物質(zhì)的量-效關(guān)系，考察各物質(zhì)之間是否存在協(xié)同作用，以整體觀解析山豆根中不限于此研究中篩選出的各物質(zhì)對(duì)疾病的干預(yù)效果。本研究一定程度上揭示了山豆根能通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑共同調(diào)控炎癥的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機(jī)制，為其臨床合理運(yùn)用以及相關(guān)藥物研發(fā)等提供了相應(yīng)理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。