薛欣怡，張 翼,2,3，廖清楠，馮昀鎧，胡雪瓊，劉亞月,2,3**

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江市腦健康海洋藥物與營(yíng)養(yǎng)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院海洋醫(yī)藥研發(fā)中心,廣東深圳 518120；3.大連工業(yè)大學(xué),海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧大連 116034)

微生物來(lái)源次級(jí)代謝產(chǎn)物是目前藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源之一。傳統(tǒng)研究主要集中在單一培養(yǎng)條件下微生物發(fā)酵液和菌絲體中活性化合物的提取分離，這導(dǎo)致經(jīng)常重復(fù)發(fā)現(xiàn)已被研究過(guò)的化合物[1]。研究人員對(duì)多種真菌和細(xì)菌進(jìn)行全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，能夠編碼化合物的基因數(shù)目非常龐大，真菌和細(xì)菌可產(chǎn)生的化合物遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目前被發(fā)現(xiàn)的化合物數(shù)量，表明微生物在單一培養(yǎng)條件下產(chǎn)生生物活性化合物的潛力被嚴(yán)重低估，很多基因可能處于沉默狀態(tài)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)敲除、引入異源表達(dá)微生物基因、調(diào)節(jié)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)突變或改變培養(yǎng)條件等方式挖掘微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇，也許會(huì)產(chǎn)生更多的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2-4]。而添加前體物質(zhì)是一種簡(jiǎn)單有效的策略，它是指在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一種在微生物生物合成過(guò)程中能易于或直接結(jié)合到最終化合物的物質(zhì)，使某些次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量有較大提高或可能產(chǎn)生新的化合物[5]。Valente等[6]研究在培養(yǎng)基中添加不同前體物質(zhì)對(duì)內(nèi)生真菌Penicilliumcrustosum次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加ferulic/quinic acids和添加cinnami/3,4-(methylenedioxy)能夠產(chǎn)生新化合物5-hydroxy-7-methoxy-4-methylphthalide。Wang等[7]在對(duì)內(nèi)生真菌SpicariaelegansKLA03培養(yǎng)過(guò)程中添加L-色氨酸和D-色氨酸，從其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到3種新的細(xì)胞松弛素，活性研究結(jié)果表明三者對(duì)A-549細(xì)胞系顯示出細(xì)胞毒活性，半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為8.2 μmol/L、20.0 μmol/L和3.1 μmol/L。自然界中存在大量的微生物，但是目前添加前體物質(zhì)對(duì)先導(dǎo)化合物影響的研究只涉及天然資源中的一小部分，尤其是內(nèi)生微生物的研究中關(guān)于通過(guò)添加前體物質(zhì)針對(duì)性改變菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的工作尚少，此方向具有巨大的研究潛力。

本研究在前期研究中發(fā)現(xiàn)，紅樹(shù)植物楊葉肖槿(Thespesiapopulnea)來(lái)源內(nèi)生真菌Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002中的次級(jí)代謝產(chǎn)物中可能具有豐富的生物堿和萜類(lèi)化合物。通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知，這兩類(lèi)化合物的前體物質(zhì)多為氨基酸和甲戊二羥酸[8,9]。因此在前期研究的基礎(chǔ)上[10,11]，本研究選取馬鈴薯葡萄糖液體(Potato Dextrose Broth，PDB)培養(yǎng)基和察氏(Czapek′s)培養(yǎng)基，分別添加2種前體物質(zhì)(甲戊二羥酸和酪氨酸)對(duì)菌株YX-001與YX-002進(jìn)行微量發(fā)酵，通過(guò)分析菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量、HPLC指紋圖譜、乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制活性、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除和鹵蟲(chóng)致死率的變化，探究添加前體物質(zhì)對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，擬為進(jìn)一步開(kāi)展菌株Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究及藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

內(nèi)生真菌Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002分別采集于廣東湛江紅樹(shù)林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的紅樹(shù)植物楊葉肖槿(Thespesiapopulnea)的根部和葉部，通過(guò)用真菌ITS引物ITS1和ITS4擴(kuò)增真菌DNA序列，所得的堿基序列在Genebank中用Blast進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)相似性分析，分別鑒定為T(mén)alaromycessp.(Genbank登錄號(hào)：MN826194)和Penicilliumsp.(Genbank登錄號(hào)：MN826202)，現(xiàn)均保存于廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院海洋藥物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDB培養(yǎng)基：稱(chēng)取馬鈴薯汁500 mL、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g和海鹽20 g，加入純水定容至1 L，置于高壓滅菌鍋滅菌30 min (1×105Pa)，備用。

Czapek′s培養(yǎng)基：稱(chēng)取蔗糖30 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01g、NaNO32 g和海鹽20 g，加入純水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.2±0.2，置于高壓滅菌鍋滅菌30 min (1×105Pa)，備用。

1.1.3 試劑與儀器

前體物質(zhì)甲戊二羥酸以水為溶劑，酪氨酸以5%的稀鹽酸為溶劑，均配制成10 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后備用。

試劑：AChE(C3389)、碘代硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine Iodide,ATCI,DA0048)、牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA,A1933)、DPPH(D9132)、海鹽(S9883)均購(gòu)自Sigma-Aldrich，5,5′-二硫代二硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoic acid,DTNB,D8130)購(gòu)自Ruibio公司，鹵蟲(chóng)卵購(gòu)自中國(guó)愛(ài)家水族館，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：WFH-201B多功能紫外透射儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司),霉菌培養(yǎng)箱及生物安全柜(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，Epoch2酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)，薄層層析板(GF254，青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備

將待培養(yǎng)的2株海洋真菌放進(jìn)霉菌培養(yǎng)箱中活化過(guò)夜(28℃、濕度80%)，而后將活化的菌種接種到預(yù)先滅菌的PDB培養(yǎng)基(200 mL)中，置于霉菌培養(yǎng)箱(28℃)中搖床(轉(zhuǎn)數(shù)120 r/min)培養(yǎng)3-4 d，待菌落孢子生長(zhǎng)茂盛，備用。

1.2.2 前體物質(zhì)的添加

采用12孔板對(duì)菌株進(jìn)行微量培養(yǎng)，每孔分別加入2 mL培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基/Czapek′s培養(yǎng)基)和200 μL種子液，置于霉菌培養(yǎng)箱(28℃)培養(yǎng)3 d后，分別加入一定量的溶劑或前體物質(zhì)(甲戊二羥酸/酪氨酸)，使樣品的終濃度為1 mg/mL，每組做3個(gè)平行，而后繼續(xù)培養(yǎng)14 d。

前體組：2 mL培養(yǎng)基、200 μL 種子液、245 μL前體溶液(甲戊二羥酸/酪氨酸)。

對(duì)照組：2 mL培養(yǎng)基、200 μL 種子液、245 μL水。

鹽酸組：2 mL培養(yǎng)基、200 μL 種子液、245 μL 5%稀鹽酸。

1.2.3 菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量及HPLC分析

將上述培養(yǎng)好的菌株分別加入等體積的甲醇浸提3次后，離心15 min (3 000 r/min)，取上層清液。減壓濃縮獲得粗提物的水溶液后，用乙酸乙酯萃取3次，再次減壓濃縮，干燥得到粗浸膏，即為樣品，稱(chēng)量并做好記錄。

HPLC分析條件：樣品用色譜純甲醇溶解，配制成濃度為5 mg/mL的溶液，進(jìn)樣量為10 μL。洗脫條件為0-10 min，5%-95%的乙腈-水梯度洗脫；10-13 min，95%乙腈-水等度洗脫；13-17 min，95%-5%的乙腈-水梯度洗脫；17-20 min，5%的乙腈-水等度洗脫，流速為0.6 mL/min。DAD檢測(cè)器信號(hào)采集波長(zhǎng)為190-400 nm，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

1.2.4 菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物活性分析

(1)AChE抑制活性測(cè)試。

采用優(yōu)化的Ellmans比色法測(cè)定AChE的體外抑制活性[12]。稱(chēng)取一定量的樣品，用甲醇溶解至10 mg/mL，在96孔板的每個(gè)孔中加入100 μL樣品溶液，待樣品中的有機(jī)溶劑揮發(fā)干，依次將1 μL二甲基亞砜(DMSO)、49 μL PBS、10 μL 0.2 U/mL AChE和20 μL DTNB加入每個(gè)孔中，置于培養(yǎng)箱保溫10min (37℃)。將孔板取出后再加入20 μL 乙酰硫代膽堿(ATCh)，繼續(xù)孵育20 min (37℃，恒溫恒濕)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定λ=405 nm處的吸光度D405，以鹽酸多奈哌齊作為AChE抑制活性測(cè)試的陽(yáng)性對(duì)照。抑制率的計(jì)算公式如下：

抑制率(%)=

100%，

其中，Dsample blank表示加入樣品和BSA組的吸光度，Dsample表示加入樣品和AChE組的吸光度，Dcontrol表示只加入AChE組的吸光度，Dblank表示只加入BSA組的吸光度。

(2)DPPH自由基清除活性測(cè)試。

采用Sharma等[13]描述的方法，在96孔板中測(cè)定DPPH自由基清除活性。樣品用甲醇溶解至10 mg/mL，備用。各反應(yīng)體系均為100 μL。將96孔板置于暗處30 min后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定λ=517 nm處各反應(yīng)體系的吸光度A，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)平行。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

清除率(%)=

100%，

其中，Asample表示含有50 μL DPPH和50 μL樣品的DMSO溶液反應(yīng)體系的吸光度，Acontrol表示含有50 μL DPPH和50 μL DMSO溶液的反應(yīng)體系的吸光度，Asample blank表示含有50 μL甲醇和50 μL樣品的DMSO溶液反應(yīng)體系的吸光度，Ablank表示含有50 μL甲醇和50 μL DMSO溶液的反應(yīng)體系的吸光度。

(3)鹵蟲(chóng)致死活性測(cè)試。

采用96孔板測(cè)試樣品對(duì)鹵蟲(chóng)的致死活性[14]。每孔加199 μL含鹵蟲(chóng)幼體的溶液(每孔約含20只鹵蟲(chóng))，制成測(cè)試培養(yǎng)板。樣品以DMSO為溶劑，濃度為10 mg/mL，每個(gè)培養(yǎng)板孔中加入1 μL樣品，終濃度為50 μg/mL，設(shè)3個(gè)平行樣。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(28℃，保持光照)后，統(tǒng)計(jì)各孔中鹵蟲(chóng)的總數(shù)和死亡數(shù)，陰性和陽(yáng)性對(duì)照分別為DMSO和秋水仙堿。鹵蟲(chóng)致死率計(jì)算公式如下：

鹵蟲(chóng)致死率(%)=[(樣品組致死率-對(duì)照組致死率)/對(duì)照組存活率]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加前體物質(zhì)前后菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和HPLC指紋圖譜變化情況

2.1.1 產(chǎn)量變化情況

對(duì)菌株YX-001[圖1(a)]而言，在兩種培養(yǎng)基中添加甲戊二羥酸都可使菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提高。在PDB培養(yǎng)基中添加酪氨酸，可使菌株YX-001的次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量降低，而在Czapek′s培養(yǎng)基中添加酪氨酸，可使該產(chǎn)量提高。進(jìn)一步分析可知，在PDB培養(yǎng)基中，酪氨酸前體組中菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于鹽酸組，表明菌株YX-001次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量增加主要是由酸性環(huán)境引起，酪氨酸的加入反而會(huì)抑制菌株YX-001的代謝；在Czapek′s培養(yǎng)基中，鹽酸組中菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量低于對(duì)照組，但酪氨酸前體組中菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量顯著高于鹽酸組，表明酸性環(huán)境可能會(huì)抑制菌株YX-001的代謝，但酪氨酸的加入可顯著促進(jìn)菌株YX-001的代謝。

對(duì)菌株YX-002[圖1(b)]而言，添加甲戊二羥酸和酪氨酸均可使菌株YX-002的次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提高，尤其是鹽酸組和酪氨酸前體組，其代謝產(chǎn)物顯著增加(P<0.000 1)。進(jìn)一步分析可知，在PDB培養(yǎng)基中，酪氨酸前體組中菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量低于鹽酸組，表明菌株YX-002次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量增加主要是由酸性環(huán)境引起；在Czapek′s培養(yǎng)基中，酪氨酸前體組中菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量顯著高于鹽酸組，表明酸性環(huán)境下，酪氨酸的加入可促進(jìn)菌株YX-002的代謝。

2.1.2 HPLC指紋圖譜變化情況

對(duì)菌株YX-001(圖2)而言，與對(duì)照組相比，在添加甲戊二羥酸和酪氨酸2種前體物質(zhì)后，除在PDB培養(yǎng)基中酪氨酸前體組中菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的吸收峰減少外，其余各實(shí)驗(yàn)組中菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的吸收峰均有增加，表明這些條件下菌株YX-001可能產(chǎn)生了新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

對(duì)菌株YX-002(圖3)而言，與對(duì)照組相比，在添加甲戊二羥酸和酪氨酸2種前體物質(zhì)后，無(wú)論是PDB培養(yǎng)基還是Czapek′s培養(yǎng)基中菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的吸收峰都明顯增多。與對(duì)照組相比，在保留時(shí)間tR=9.5 min處的新的吸收峰僅在甲戊二羥酸和酪氨酸前體組中出現(xiàn)，而鹽酸組沒(méi)有，表明該吸收峰可能是由于添加甲戊二羥酸和酪氨酸前體產(chǎn)生的。

x-y is sample number,x represents medium (1 represents PDB medium,2 represents Czapek′s medium)，y represents added precursor or solvent (1 for mevalondihydroxy acid,2 for hydrochloric acid and 3 for tyrosine).**** indicates comparison with the control group,P<0.000 1圖1 菌株YX-001和YX-002在不同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)量Fig.1 Yield of strains YX-001 and YX-002 obtained under different media conditions

2.2 添加前體物質(zhì)前后菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物生物活性的變化情況

2.2.1 AChE抑制活性

對(duì)菌株YX-001[圖4(a)]而言，在PDB培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸可降低菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性，而添加酪氨酸可使該活性增加。由于鹽酸組的AChE抑制活性低于對(duì)照組，表明在PDB培養(yǎng)基中，使AChE抑制活性增加的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。在Czapek′s培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸均可增加菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性。

對(duì)菌株YX-002[圖4(b)]而言，在PDB培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸均可降低AChE抑制活性，且酪氨酸的效果更為顯著；在Czapek′s培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸可顯著降低菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性，而添加酪氨酸可使該活性增加。由于鹽酸組的AChE抑制活性低于對(duì)照組，表明在Czapek′s培養(yǎng)基中，使菌株AChE抑制活性增大的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。

Dotted boxes indicate areas of change in emphasis,arrow points to newly added or disappeared absorption peak圖2 添加前體物質(zhì)前后菌株YX-001次級(jí)代謝產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of secondary metabolites of strain YX-001 before and after feeding precursor

Dotted boxes indicate areas of change in emphasis,arrow points to newly added or disappeared absorption peak圖3 添加前體物質(zhì)前后菌株YX-002次級(jí)代謝產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of secondary metabolites of strain YX-002 before and after feeding precursor

x-y is sample number,x represents medium (1 represents PDB medium,2 represents Czapek′s medium),y represents added precursor or solvent (1 for mevalondihydroxy acid,2 for hydrochloric acid and 3 for tyrosine).**** indicates comparison with the control group,P<0.000 1圖4 菌株YX-001和YX-002次級(jí)代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性Fig.4 AChE inhibitory activity of secondary metabolites of strains YX-001 and YX-002

2.2.2 DPPH自由基清除活性

對(duì)菌株YX-001[圖5(a)]而言，在PDB培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸可增加菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性。由于鹽酸組的DPPH自由基清除活性低于對(duì)照組，說(shuō)明使DPPH自由基清除活性增加的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。在Czapek′s培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性無(wú)明顯變化，而添加酪氨酸可增加DPPH自由基清除活性。鹽酸組的DPPH自由基清除活性高于對(duì)照組，且與酪氨酸前體組效果基本一致。由此推測(cè)，在Czapek′s培養(yǎng)基中使DPPH自由基清除活性增加的可能是鹽酸，而不是酪氨酸。

x-y is sample number,x represents medium (1 represents PDB medium,2 represents Czapek′s medium)，y represents added precursor or solvent (1 for mevalondihydroxy acid,2 for hydrochloric acid and 3 for tyrosine).**** indicates comparison with the control group,P<0.000 1圖5 菌株YX-001和YX-002次級(jí)代謝產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH free radical scavenging activity of secondary metabolites of strains YX-001 and YX-002

對(duì)菌株YX-002[圖5(b)]而言，在PDB培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸可降低菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性，而添加酪氨酸可提高該活性。與對(duì)照組相比，鹽酸組對(duì)菌株的DPPH自由基清除活性具有抑制作用，表明在PDB培養(yǎng)基中，使菌株YX-002 DPPH自由基清除活性增大的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。在Czapek′s培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸均可增加菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性。但鹽酸組的DPPH自由基清除活性增加量大于酪氨酸組，由此推測(cè)該條件下使菌株YX-002 DPPH自由基清除活性增大的原因在于鹽酸，而不是酪氨酸。

2.2.3 鹵蟲(chóng)致死活性

對(duì)菌株YX-001[圖6(a)]而言，在PDB培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸可增加菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲(chóng)致死活性。由于鹽酸組的鹵蟲(chóng)致死活性低于對(duì)照組，說(shuō)明酪氨酸的加入是鹵蟲(chóng)致死活性增加的原因。在Czapek′s培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸后菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲(chóng)致死活性無(wú)明顯變化，而添加酪氨酸可使該活性明顯增加。綜上表明，添加前體物質(zhì)甲戊二羥酸和酪氨酸可能會(huì)增加菌株YX-001次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲(chóng)致死活性。

對(duì)菌株YX-002[圖6(b)]而言，在PDB培養(yǎng)基中，添加前體物質(zhì)甲戊二羥酸和酪氨酸對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲(chóng)致死活性均具有一定的降低作用；在Czapek′s培養(yǎng)基中，添加甲戊二羥酸可降低菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲(chóng)致死活性，添加酪氨酸可使鹵蟲(chóng)致死活性顯著增加。在Czapek′s培養(yǎng)基中，與對(duì)照組相比，鹽酸組對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲(chóng)致死活性具有抑制作用，表明使菌株YX-002次級(jí)代謝產(chǎn)物鹵蟲(chóng)致死活性增大的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。

x-y is sample number,x represents medium (1 represents PDB medium,2 represents Czapek′s medium),y represents added precursor or solvent (1 for mevalondihydroxy acid,2 for hydrochloric acid and 3 for tyrosine).**** indicates comparison with the control group,P<0.000 1圖6 菌株YX-001和YX-002次級(jí)代謝產(chǎn)物的鹵蟲(chóng)致死活性Fig.6 Artemia lethal activity of secondary metabolites of strains YX-001 and YX-002

3 討論

自20世紀(jì)60年代末開(kāi)始，海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物作為一種新的活性物質(zhì)來(lái)源，其相關(guān)研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外海洋科技工作者的重視，并且由于基因工程、DNA重組、發(fā)酵工程等生物技術(shù)的發(fā)展，使得近20年來(lái)從海洋微生物中分離得到的次級(jí)代謝產(chǎn)物逐年增加[15]。而作為海洋微生物重要組成部分的海洋真菌，因其種類(lèi)繁多，次級(jí)代謝產(chǎn)物類(lèi)型豐富等優(yōu)勢(shì)而受到廣泛的關(guān)注[16]。2019年共報(bào)道了1 490個(gè)新化合物，其中來(lái)源于海洋真菌的新化合物占將近一半(47%)，并且每年新發(fā)現(xiàn)的海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物數(shù)量仍在逐年上升，海洋真菌已成為海洋活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的主力軍[17]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，產(chǎn)活性物質(zhì)的真菌多來(lái)自青霉屬Penicilliumsp.、擬青霉屬Paecilomycessp.、曲霉屬Aspergillussp.、木霉屬Trichodermasp.、腐質(zhì)霉屬Humicolasp.、毛殼菌屬Chaetomiumsp.、鏈格孢屬Alternariasp.、枝孢屬Cladosporiumsp.等[17]。

目前對(duì)青霉屬和藍(lán)狀菌屬Talaromycessp.真菌的研究主要集中于利用傳統(tǒng)方式對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離鑒定與生物活性初步篩選評(píng)價(jià)[18-21]，而通過(guò)改變培養(yǎng)條件、化學(xué)誘導(dǎo)或基因敲除等方式挖掘微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇，使之產(chǎn)生更多具有較好活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的文獻(xiàn)報(bào)道仍然較少。陳夏雨等[22]采用單菌多次級(jí)代謝產(chǎn)物(OSMAC)策略對(duì)1株采自南海深海沉積環(huán)境的白黃筍頂孢霉屬真菌AcrostalagmusluteoalbusSCSIO F457進(jìn)行化學(xué)多樣性的初步研究，通過(guò)在不同培養(yǎng)基、pH與鹽度條件下對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)調(diào)控，篩選出2種適宜條件進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，最終從發(fā)酵產(chǎn)物中共新增分離鑒定11個(gè)單體化合物。陳海立[23]以?xún)芍耆邇?nèi)生真菌(PreussiaisomeraXL-1326和TalaromycespurpureogenusXL-025)為研究對(duì)象，分別使用8種不同培養(yǎng)基小規(guī)模發(fā)酵，通過(guò)比較其次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成能力，選取下一步擴(kuò)大發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，最終共分離得到30個(gè)具有較好抗植物病原真菌、抗耐藥性致病細(xì)菌等藥理活性的單體化合物。Wang等[24]在真菌Penicilliumcitreonigrum的發(fā)酵過(guò)程中添加濃度為50 μmol/L的DNA甲基化酶抑制劑5-azaC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲體形態(tài)與對(duì)照組相比發(fā)生了很大變化，而且通過(guò)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，激活后的菌株產(chǎn)生了10個(gè)新色譜峰，進(jìn)一步對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物分離純化后得到2個(gè)新的萜類(lèi)化合物(atlantinone A和atlantinone B)。上述研究表明，通過(guò)改變培養(yǎng)條件或添加誘導(dǎo)劑等方式，可使目標(biāo)菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，使之產(chǎn)生更多活性豐富、結(jié)構(gòu)獨(dú)特的化合物。

楊葉肖槿由于具有強(qiáng)大的增強(qiáng)記憶功效和抗氧化、抗炎等活性，是潛在的AChE抑制劑先導(dǎo)化合物來(lái)源[25]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅樹(shù)植物楊葉肖槿的研究主要集中在植物本身的化學(xué)成分及藥理活性上，尚未見(jiàn)對(duì)其來(lái)源內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物及生物活性的有關(guān)報(bào)道。本研究首次探究了添加不同前體物質(zhì)對(duì)楊葉肖槿內(nèi)生真菌Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002的次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響。研究結(jié)果表明，除菌株YX-001在PDB培養(yǎng)基條件下，添加酪氨酸前體后其次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和化學(xué)多樣性降低外，其余情況均能增加2株菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和化學(xué)多樣性，但生物活性的變化有所不同。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境可能會(huì)促進(jìn)具有較好DPPH自由基清除活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。部分實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并沒(méi)有達(dá)到明顯變化的預(yù)期效果，可能有兩種原因：(1)菌株前體物質(zhì)選擇不合適。由于次級(jí)代謝產(chǎn)物在生物體內(nèi)合成途徑的復(fù)雜性，其中可能含有多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的活性化合物，這些化合物并不是單純的以甲戊二羥酸或酪氨酸為前體，而是以更復(fù)雜的組合形式或者由它們的復(fù)合途徑作為前體，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象變化不明顯，具體的結(jié)論有待后續(xù)進(jìn)一步探索。(2)發(fā)生變化的次級(jí)代謝產(chǎn)物本身比較微量或者痕量，而主產(chǎn)物的產(chǎn)量過(guò)大，導(dǎo)致其實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象變化不明顯，因此在后期實(shí)驗(yàn)中可以考慮擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)或去除主產(chǎn)物，進(jìn)而探究添加前體物質(zhì)對(duì)那些微量次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響。

4 結(jié)論

本研究表明，添加甲戊二羥酸和酪氨酸前體物質(zhì)對(duì)2株菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和化學(xué)多樣性整體具有較好的促進(jìn)效果，但對(duì)AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲(chóng)致死活性等生物活性在不同條件下的影響有較大差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境可能會(huì)促進(jìn)具有較好DPPH自由基清除活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成，但其具體機(jī)制的確定還有待進(jìn)一步研究。本研究為深入研究楊葉肖槿內(nèi)生真菌Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002的次級(jí)代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。