唐茵茹，黃芝瑛，汪祺，文海若，馬雙成

1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

中藥在我國的使用歷史可以追溯到幾千年前，現(xiàn)今仍然被廣泛用于臨床治療。國務(wù)院辦公廳于2019 年發(fā)布《關(guān)于促進(jìn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見》，從國家層面扶持和促進(jìn)中醫(yī)藥行業(yè)的傳承與發(fā)展?？梢灶A(yù)見中藥的研究及應(yīng)用規(guī)模將進(jìn)一步擴(kuò)大。與此同時(shí)，越來越多的中藥被報(bào)道具有潛在的肝毒性，引起社會(huì)廣泛重視。其中，藥物引起的肝臟損傷是新藥臨床試驗(yàn)和上市后被撤回的主要原因之一，因此在藥物研發(fā)階段檢測和評估藥物的肝毒性一直是制藥行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)重點(diǎn)關(guān)注的問題[1]。研究數(shù)據(jù)表明，2012—2014 年我國發(fā)生的藥源性肝損傷事件中有26.81%是由中藥引起[2]。其毒性機(jī)制包括氧化應(yīng)激、線粒體損傷和凋亡、膽汁淤積、脂肪變性、產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物等。此外，藥物間相互作用也是導(dǎo)致肝臟損傷的重要原因。例如，黃芩中的吡啶生物堿和二萜類成分就是典型的通過肝細(xì)胞色素P450（CYP）3A4 代謝產(chǎn)生的肝毒素，可通過上調(diào)CYP3A4 活性加劇不良反應(yīng)[3]。此外，麻黃、雷公藤、何首烏、川楝子、補(bǔ)骨脂、半夏等都是常見的具有肝毒性的中藥[4]。因此，在中藥的開發(fā)與研究過程中，明確其不良反應(yīng)及機(jī)制并探索安全劑量，從而增強(qiáng)中藥使用的安全性，將有助于中醫(yī)藥事業(yè)的傳承與發(fā)展，有利于中醫(yī)藥獲得國際的認(rèn)可。

目前公認(rèn)的藥物臨床前安全性評價(jià)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為主，然而整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大多耗時(shí)長且費(fèi)用較高。自1980 年起，為提高動(dòng)物福利，歐洲多國先后頒布動(dòng)物保護(hù)法，提倡實(shí)行“3R”原則，即替代（replacement）、減少（reduction）和優(yōu)化（refinement），減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用[5]。這也推進(jìn)了許多體外毒理學(xué)預(yù)測模型的開發(fā)和應(yīng)用。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多效用的特點(diǎn)，不同成分間可能存在相互作用，其引起肝臟損傷所涉及的靶點(diǎn)主要包括代謝酶、核受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、活性氧（ROS）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等介導(dǎo)的信號通路，給中藥肝毒性及安全性評價(jià)造成諸多困難[4]。因此，建立能高效篩選中藥中肝毒性成分和評價(jià)中藥對肝細(xì)胞綜合作用的體外模型尤為重要。其中，三明治肝細(xì)胞培養(yǎng)（sandwich-cultured hepatocytes，SCH）模型是當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的研究藥物肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)和膽汁淤積的體外模型。該模型將肝細(xì)胞置于2 層膠原中，以三明治夾心的結(jié)構(gòu)進(jìn)行培養(yǎng)，能達(dá)到模擬體內(nèi)生長條件、重建肝細(xì)胞極性的目的。Dunn 等[6]研究表明，SCH 模型中大鼠原代肝細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和白蛋白分泌功能可維持42 d。本文將對SCH 模型培養(yǎng)的特點(diǎn)、方法及近年來其在中藥肝毒性評價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并就其與其他體外肝毒性評價(jià)模型相比較的優(yōu)勢、不足及今后改良的方向進(jìn)行探討。

1 SCH模型的特點(diǎn)

肝細(xì)胞是有6～8個(gè)面的多角形細(xì)胞，其中每個(gè)肝細(xì)胞表面均由膽管側(cè)膜面、血竇面和肝細(xì)胞面3個(gè)功能面組成[7]。研究表明，SCH模型能較長時(shí)間地保持肝細(xì)胞的形態(tài)和活力、重建肝細(xì)胞的極性、模擬肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。SCH 模型可表達(dá)鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（Na+-dependent taurocholic cotrans-porting polypeptide，NTCP）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（organic anion transporter，OAT）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic anion transporting polypeptide，OATP）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥性蛋白1（multidrug resistance protein 1，MDR1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）、膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等轉(zhuǎn)運(yùn)體及CYP 酶、磺基轉(zhuǎn)移酶等藥物代謝酶，亦可持續(xù)分泌尿素、白蛋白、膽汁酸等肝特異性蛋白和有機(jī)物（圖1）[8-10]。大鼠原代肝細(xì)胞經(jīng)三明治夾心培養(yǎng)后第4 天即可形成廣泛的膽小管網(wǎng)絡(luò)和基底外側(cè)結(jié)構(gòu)域，且至少能維持2～3 周[11]。因此，SCH 模型常用于預(yù)測藥物的肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)與膽汁排泄、藥物相互作用、膽汁淤積等研究中[12]。

2 三明治肝細(xì)胞培養(yǎng)體系的制備

2.1 肝細(xì)胞的分離

原代肝細(xì)胞的分離方法主要分為非灌流法和灌流法。前者操作簡便，但獲取的肝細(xì)胞數(shù)量較少且成活率低；后者則需要特殊的灌流裝置，所分離細(xì)胞的純度和活性均明顯優(yōu)于非灌流法[13]。其中Seglen 兩步灌流法是目前常用的原代肝細(xì)胞分離方法，首先用含陽離子螯合劑、不含鈣離子和鎂離子的D-Hank′s 溶液灌注肝組織，將肝組織中血液完全排出；接著用含鈣離子和膠原酶的Hank′s 溶液繼續(xù)灌注，以消化周圍組織；最后撕去肝臟包膜并收集細(xì)胞懸液[14]。

2.2 肝細(xì)胞的培養(yǎng)

分離得到的肝細(xì)胞可接種于預(yù)先包被肝細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的培養(yǎng)板中，待其貼壁后吸除培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去未貼壁的細(xì)胞，再鋪上第2 層ECM，即可構(gòu)成三明治培養(yǎng)體系。ECM 除可以為肝細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)性支持外，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和遷移，影響MRP2、BSEP的表達(dá)和活性。常用的ECM 為Ⅰ型膠原和Matrige Ⅰ?，前者由大鼠尾部肌腱中提取獲得，后者是由小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的含有黏連蛋白和Ⅳ膠原的復(fù)合蛋白混合物。與Ⅰ型鼠尾膠原相比，使用Matrige Ⅰ?的肝細(xì)胞更容易聚集，形成更廣泛的膽小管網(wǎng)絡(luò)。此外，Matrige Ⅰ?的操作簡便，更適合于高通量篩選[12,15]。

肝細(xì)胞接種的密度對細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞間接觸至關(guān)重要。人和大鼠原代細(xì)胞最佳的接種密度分別為1.8×105、1.5×105個(gè)/cm2。細(xì)胞密度過低會(huì)影響細(xì)胞間接觸，導(dǎo)致肝細(xì)胞扁平化和纖維化；密度過高則會(huì)干擾細(xì)胞黏附，同時(shí)抑制MRP2和MDR1a/1b的表達(dá)和活性[12]。

三明治培養(yǎng)體系所使用的培養(yǎng)基中應(yīng)包含氨基酸、激素、維生素、微量元素和輔因子。常用的培養(yǎng)基有DMEM、WME 和氨基酸含量更高的MCM、L15。Chandra 等[16]的研究結(jié)果表明，使用WME 培養(yǎng)基的肝細(xì)胞和膽小管網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)都更接近體內(nèi)實(shí)際情況，?；悄懰岬哪懝芡馀胖笖?shù)也較其他培養(yǎng)基高。而MCM 培養(yǎng)基則更有利于保持肝細(xì)胞的形態(tài)，穩(wěn)定肝特異性酶的活性和減少自噬蛋白的降解，這可能與其氨基酸含量更高有關(guān)[16]。

在細(xì)胞接種后的24 h 內(nèi)，培養(yǎng)基中應(yīng)添加5%～10%的胎牛血清，促進(jìn)肝細(xì)胞貼壁并改善細(xì)胞的形態(tài)。但血清也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化和抑制膽小管重建，因此應(yīng)合理控制添加血清的時(shí)間[17]。此外，培養(yǎng)基中添加低劑量（0.1～1.0 μmol·L–1）的地塞米松可以促進(jìn)肝細(xì)胞附著于ECM、增強(qiáng)細(xì)胞分泌白蛋白能力和改善膽小管網(wǎng)絡(luò)；而高劑量（10 μmol·L–1）的地塞米松則能誘導(dǎo)CYP3A 和胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)[12]。據(jù)報(bào)道，添加胰島素也能改善肝細(xì)胞的存活率和貼壁率、增強(qiáng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)的合成效率、促進(jìn)糖原和脂肪的合成[11]。

隨著技術(shù)的發(fā)展，近年來有研究將微流控芯片技術(shù)和肝細(xì)胞整合。微流控芯片是由硅、玻璃、高分子聚合物等材料制作而成，具有過濾器、流體通道、反應(yīng)室、檢測室、傳感器等元件，能在微米級別操控流體，配合自動(dòng)分析儀器能完成提取、分析等過程[18]。與其他培養(yǎng)方法相比，微流控芯片技術(shù)能模擬生理?xiàng)l件下的血液動(dòng)力學(xué)過程，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，同時(shí)還能調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)或藥物的濃度產(chǎn)生濃度梯度。微流控芯片培養(yǎng)的肝臟組織已被用于肝臟生理學(xué)、肝臟疾病模型、藥物肝毒性反應(yīng)、新藥篩選等研究中[19-20]。

3 SCH模型在中藥肝毒性評價(jià)中的應(yīng)用

中藥導(dǎo)致肝臟損傷的機(jī)制主要包括：1）影響CYP酶代謝；2）干擾內(nèi)源性化合物（如膽紅素、膽汁酸）的轉(zhuǎn)運(yùn)；3）抑制膽汁排泄誘發(fā)膽汁淤積；4）直接引起細(xì)胞器損傷[12]。已有大量研究應(yīng)用SCH 針對上述毒性機(jī)制開展研究。

3.1 評價(jià)中藥對CYP酶的影響

CYP 酶為單加氧酶的一種，因其還原狀態(tài)在450 nm 下有最大吸收波長而得名。CYP 酶以血紅素鐵卟啉為催化活性中心，參與多種外源物質(zhì)的Ⅰ相代謝反應(yīng)，包括羥基化、脫鹵、脫氨、環(huán)氧化等，是機(jī)體重要的代謝酶系[21]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，75%的藥物進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)由CYP 酶系進(jìn)行代謝，這其中95%的反應(yīng)是由CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP1A2 5 種酶介導(dǎo)[22]。中藥尤其是中藥復(fù)方成分復(fù)雜，對CYP 酶產(chǎn)生抑制或誘導(dǎo)效應(yīng)都有可能延長藥效成分或其他活性代謝物在體內(nèi)的作用時(shí)間，增加藥物源性肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。研究提示，黃獨(dú)素B、黃樟油、大黃酸等中藥活性單體的肝毒性機(jī)制均與CYP 酶功能和水平的變化有關(guān)[23]。因此，研究代謝酶介導(dǎo)的藥物-藥物相互作用和肝毒性機(jī)制對于臨床上中藥的增效減毒具有重要的意義[4,23]。SCH 模型中正常表達(dá)的藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體使其成為重要的中藥代謝研究體外模型。Kirby 等[24]研究利托那韋和奈非那韋對SCH 模型和肝微粒體中CYP3A4 的抑制作用，結(jié)果顯示，在利托那韋和奈非那韋處理下，肝微粒體中CYP3A4 的活性分別比SCH 模型中的高13、4 倍，因此，與肝微粒體相比，使用SCH 模型能更準(zhǔn)確地預(yù)測藥物對CYP的抑制作用。

Shen 等[25]構(gòu)建了SCH 模型，以咪達(dá)唑侖為探針?biāo)幬?，研究雷公藤甲素（triptolide，TP）的肝毒性機(jī)制，結(jié)果顯示，TP 以質(zhì)量濃度依賴性的方式抑制CYP3A 的活性，CYP3A4抑制劑能加劇TP對肝細(xì)胞的毒性，CYP3A4 誘導(dǎo)劑則能緩解TP 的毒性，提示CYP3A4 的活性可能與TP 的肝毒性機(jī)制有關(guān)，在臨床中TP 應(yīng)盡量避免與CYP3A4 的抑制劑聯(lián)用。Zhuang 等[26]利用SCH 模型證實(shí)CYP3A 活性的抑制會(huì)導(dǎo)致TP 的肝毒性增強(qiáng)。Jackson 等[27]發(fā)現(xiàn)在SCH模型上，五味子提取物能抑制CYP3A4/5 的活性并增加CYP3A4 mRNA 水平，由此推測五味子提取物可能會(huì)與經(jīng)由CYP3A4/5 代謝的藥物產(chǎn)生藥物-藥物相互作用。

3.2 評價(jià)中藥導(dǎo)致的膽汁淤積

膽汁淤積是指肝內(nèi)外各種原因?qū)е碌哪懼纬伞⒎置诤团判拐系K，進(jìn)而導(dǎo)致膽汁不能正常進(jìn)入十二指腸而反流入血的病理狀態(tài)[28]。在正常生理狀態(tài)下肝細(xì)胞通過自身合成或血竇側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NTCP 和OATP 攝取膽汁酸。膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)被葡萄糖醛酸化或硫酸化，隨后通過BSEP和MRP2排泄至膽汁中。膽汁排泄后，膽汁酸能通過回腸轉(zhuǎn)運(yùn)體重新吸收至門靜脈，并再次被肝細(xì)胞血竇側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)體所攝取。因此，任何能干擾膽汁酸正常循環(huán)的外源性物質(zhì)均有可能引起膽汁淤積并導(dǎo)致肝臟損傷[29]。調(diào)查顯示，在中藥藥源性肝損傷事件中，4.8%的患者出現(xiàn)膽汁淤積的臨床癥狀，6.7%的患者表現(xiàn)為肝實(shí)質(zhì)損傷合并膽汁淤積[30]。因此，建立能預(yù)測中藥誘導(dǎo)膽汁淤積型肝毒性的體外模型是研究人員重點(diǎn)關(guān)注的問題之一。

SCH 模型因能表達(dá)膽汁酸循環(huán)相關(guān)的酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而成為極有潛力的研究藥物性膽汁淤積的體外模型。體系中能形成具有正常形態(tài)和功能的膽小管結(jié)構(gòu)，在含Ca2+/Mg2+的緩沖液中，膽小管結(jié)構(gòu)能維持正常功能；而在不含Ca2+/Mg2+的緩沖液中，細(xì)胞的緊密連接無法維持，膽小管結(jié)構(gòu)被破壞，管腔中的物質(zhì)將會(huì)擴(kuò)散至培養(yǎng)液中。因此含Ca2+/Mg2+緩沖液下的細(xì)胞和管腔內(nèi)底物總量與不含Ca2+/Mg2+緩沖液下細(xì)胞內(nèi)底物總量之差即為排泄進(jìn)入膽小管的底物量[31]。研究中常使用氘標(biāo)記的牛磺膽汁酸（d5-TCA）、氘標(biāo)記的甘氨鵝脫氧膽酸（d4-GCDCA）和羧基二氯熒光素（CDCFDA）作為探針底物，評價(jià)藥物對轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響。d5-TCA 和d4-GCDCA 是膽管側(cè)外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體BESP、血竇側(cè)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體NTCP 及血竇側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP3 和MRP4 的底物，利用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）測定細(xì)胞內(nèi)這2 種底物的濃度即可計(jì)算膽汁外排指數(shù)，間接反映藥物對上述幾種轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響。CDCFDA 進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶代謝得到的5(6)-羧基-2,7 二氯熒光素（CDF）是膽管側(cè)外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2 和血竇側(cè)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP3 的底物，且CDF 是一種熒光物質(zhì)，可使用酶標(biāo)儀檢測熒光吸收值測定其含量[32]。

康麗[31]在SCH 模型中分別使用d5-TCA、d4-GCDCA 和CDCFDA 作探針，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫印跡法（Western blot）評價(jià)何首烏中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能和表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確何首烏致肝臟毒性的機(jī)制。Wu 等[33]發(fā)現(xiàn)在SCH 模型中知母皂苷A3能抑制d8-TCA 的攝取和膽汁排泄，同時(shí)從mRNA 和蛋白水平上抑制膽汁酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，即知母皂苷A3的肝毒性機(jī)制可能與膽汁淤積有關(guān)。膽汁淤積是治療肺結(jié)核的一線藥物利福平常見的不良反應(yīng)之一，劉蕾等[34]利用SCH 模型研究利福平及聯(lián)用丹參酮ⅡA對BSEP 底物普伐他汀的膽管外排的影響，其結(jié)果表明利福平引起膽汁淤積的機(jī)制與BSEP 抑制有關(guān)，且聯(lián)用丹參酮ⅡA能減弱BSEP的抑制作用，緩解膽汁淤積，為臨床上預(yù)防利福平引起膽汁淤積提供依據(jù)。

除了膽汁酸以外，膽紅素是另一種依賴膽汁排泄的內(nèi)源性物質(zhì)。唐志芳等[35]利用SCH 模型研究何首烏炮制前后對膽紅素外排的影響，結(jié)果提示何首烏與制何首烏能抑制MRP2 的功能，導(dǎo)致膽紅素的膽汁排泄減少，進(jìn)而引發(fā)膽汁淤積。

3.3 評價(jià)中藥的其他肝毒性機(jī)制

通過檢測SCH 模型中有和無Ca2+/Mg2+緩沖液條件下藥物在細(xì)胞內(nèi)的累積量，計(jì)算膽汁外排指數(shù)和清除率，可推斷藥物的動(dòng)力學(xué)過程和毒性反應(yīng)機(jī)制。Zhuang 等[26]利用SCH 模型發(fā)現(xiàn)在P-gp 抑制劑ritonavir 和tariquidar 的作用下，TP 的膽汁清除率分別下降73.7%和84.2%；而在P-gp 誘導(dǎo)劑作用下，TP的膽汁清除率可增加2倍，表明P-gp介導(dǎo)了TP的膽汁外排過程。梁瑞峰等[36]也利用該模型研究了有和無P-gp、MRP2抑制劑對黃連中3個(gè)活性成分小檗堿、巴馬汀和藥根堿的膽汁外排指數(shù)的影響，從而確定是P-gp 而不是MRP2 介導(dǎo)這3 個(gè)活性成分的膽汁排泄。

4 SCH與其他肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的對比

SCH 與其他肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型相比主要有兩大優(yōu)勢，即可較好地模擬體內(nèi)肝細(xì)胞環(huán)境及較長時(shí)間維持肝細(xì)胞狀態(tài)，藥物代謝能力較好。但培養(yǎng)過程中需要每天更換培養(yǎng)基，且不適合用于96 孔板培養(yǎng)。

盡管傳統(tǒng)的2D 培養(yǎng)操作簡便且成本相對較低，但是無法有效地模擬實(shí)際體內(nèi)環(huán)境。在生理?xiàng)l件下，肝細(xì)胞呈三維立體的方式生長，能與其他細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，這有利于維持良好的細(xì)胞形態(tài)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，并形成正常的增生和分化功能。因此，3D 培養(yǎng)能更好地模擬肝細(xì)胞在生理狀態(tài)下的形態(tài)和活性，對于提高預(yù)測藥物代謝和毒性反應(yīng)的準(zhǔn)確性具有重要的意義[37]。肝細(xì)胞的3D 培養(yǎng)模型主要分為有支架和無支架2 種。支架能為細(xì)胞間的連接和肝細(xì)胞聚集體的形成提供良好的支撐作用，常用的支架材料包括殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白等。而無支架的方法則是通過使用無黏附性的培養(yǎng)皿、生物反應(yīng)器或懸滴培養(yǎng)等方法，使肝細(xì)胞自發(fā)形成球狀聚集體[18,38]。

此外，早期常用的肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型為2D 平面培養(yǎng)模型，模型中肝細(xì)胞為扁平狀，且具備大部分肝臟特異性的功能，如糖原合成、蛋白質(zhì)的合成和分泌、尿素生成、膽汁酸的合成和吸收、代謝外源性物質(zhì)等[18]。但是由于2D 培養(yǎng)的肝細(xì)胞缺少細(xì)胞間接觸和細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)的接觸，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，其形態(tài)和極性都與體內(nèi)肝細(xì)胞有較大差異，對藥物的代謝能力也會(huì)急劇下降，因此不適用于長期給藥研究。與2D培養(yǎng)相比，SCH模型的肝臟特異性功能明顯提高，能重建肝細(xì)胞極性，形成廣泛的類膽小管結(jié)構(gòu)，是研究藥物肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)和膽汁淤積最有力的模型。但是在長期培養(yǎng)的過程中，SCH 模型仍不可避免地喪失肝細(xì)胞原有的形態(tài)和功能，相關(guān)的藥物代謝酶活性也逐漸下降。不同肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型及比較見圖2和表1。

5 結(jié)語與展望

中藥毒性作用靶點(diǎn)不明確是限制其發(fā)展的重要因素之一。與其他肝毒性體外評價(jià)模型相比，SCH模型能模擬在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物代謝酶共同作用下的生物學(xué)效應(yīng)，在研究藥物肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)和藥源性肝損傷機(jī)制方面具有突出的優(yōu)勢。但是隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，肝細(xì)胞仍然不可避免地去分化，喪失部分肝臟特異性生物活性。因此研究人員通過調(diào)整培養(yǎng)基組成和更換ECM 種類等方法獲得最佳的培養(yǎng)條件。據(jù)報(bào)道，將肝細(xì)胞和其他非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞（如星狀細(xì)胞，竇狀內(nèi)皮細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞）以三明治夾心的結(jié)構(gòu)進(jìn)行共培養(yǎng)，能更好地模擬肝臟正常的結(jié)構(gòu)和生物活性，活性可至少維持4 周[41]。應(yīng)用SCH 模型進(jìn)行毒性研究時(shí)也應(yīng)考慮細(xì)胞來源的問題。原代肝細(xì)胞保留了多種肝臟特異性功能，是體外研究藥物肝毒性的金標(biāo)準(zhǔn)。但其來源獨(dú)特、應(yīng)用成本較高且無法批量生產(chǎn)，因此應(yīng)用受到限制。而在使用癌細(xì)胞系、多能干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞等細(xì)胞系時(shí)，應(yīng)充分考慮實(shí)驗(yàn)的需要和細(xì)胞系的特點(diǎn)，選擇合適的細(xì)胞，如HepG2 細(xì)胞中CYP450 酶活性普遍不高，不適用于與CYP 酶相關(guān)的毒性研究中；人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源肝細(xì)胞BESP 低水平表達(dá)，不適用于膽汁淤積的研究[42]。通過不斷改良和優(yōu)化SCH 模型構(gòu)建方法，模型用于預(yù)測藥物肝毒性的風(fēng)險(xiǎn)和研究毒性機(jī)制的價(jià)值將會(huì)大大提高，有望成為體外評價(jià)藥物肝毒性的有力工具。