舒軍霞，楊 林，周 濤，沈蓮文，王大瑋*

刺柏屬4種藥用植物葉綠體基因組密碼子偏好性分析

舒軍霞1，楊 林1，周 濤1，沈蓮文2，王大瑋1*

1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224 2. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224

明確刺柏屬圓柏、垂枝香柏、昆明柏和鋪地柏4種藥用植物葉綠體基因組密碼子的使用偏好性及影響其密碼子偏好性的因素。利用CodonW、CUSP、SPSS等軟件對4種刺柏屬藥用植物葉綠體基因組密碼子偏好性進行分析。4種刺柏屬藥用植物葉綠體基因組密碼子的GC含量在35.8%～37.3%，有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）值在47.10～47.79，表明其密碼子偏好性較弱。中性繪圖、ENC-plot、PR2-plot分析表明影響4種刺柏屬藥用植物葉綠體基因組密碼子使用偏性的因素有選擇和突變。同時利用相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，）值和ENC值篩選出共65個最優(yōu)密碼子，其中有9個密碼子為4種刺柏屬植物共有的最優(yōu)密碼子。4種刺柏屬藥用植物密碼子偏好使用A/T結(jié)尾，其密碼子使用偏性主要受到自然選擇的影響。通過對4種刺柏屬植物葉綠體基因組密碼子的使用偏性進行分析及外類群聚類分析驗證，揭示影響其密碼子使用偏性的主要因素，為后續(xù)刺柏屬葉綠體基因組外源蛋白表達載體的構(gòu)建及優(yōu)化提供理論依據(jù)。

刺柏屬；圓柏；垂枝香柏；昆明柏；鋪地柏；密碼子偏好性；最優(yōu)密碼子；自然選擇

葉綠體基因組是高等植物細胞質(zhì)基因組的組成成分之一，攜帶大量自我調(diào)節(jié)的編碼基因。與核基因組相比具有序列長度適中、基因直系同源、進化速率適中等優(yōu)勢[1-2]。這些優(yōu)勢可以用于揭示物種起源、進化、演變及比較基因組學(xué)等研究方向[3-5]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的植物葉綠體基因組得到了測序和組裝。因此，葉綠體基因組已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育研究、物種鑒定、葉綠體基因工程和遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面的研究，為植株的多抗性轉(zhuǎn)化、農(nóng)作物代謝途徑改造等方面奠定理論依據(jù)[6-7]。

密碼子是生物體內(nèi)mRNA（或DNA）上的3聯(lián)體核苷酸殘基序列，是遺傳信息的序列單位，參與mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程[8]。密碼子的使用偏好性是指某一物種或某一基因在蛋白質(zhì)翻譯過程中傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子的現(xiàn)象[9]。目前對密碼子偏好性的研究主要集中在分子進化、翻譯調(diào)控等方面[10-11]。研究表明，密碼子偏好性可以通過改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、核苷酸序列等方式影響外源基因的表達[12-13]。因此，對密碼子偏好性的分析可提供密碼子偏好性優(yōu)化策略，進而為利用基因工程技術(shù)改良植物重要性等研究奠定理論基礎(chǔ)。

圓柏L.、垂枝香柏W. C. Cheng ex Ferré、昆明柏W. C. Cheng和鋪地柏(Endlicher) Siebold ex Miquel均屬于柏科刺柏屬植物，主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)。刺柏屬植物是具有藥用、景觀、生態(tài)價值的經(jīng)濟樹種。刺柏屬植物的枝葉中含有具抗炎、抑菌效果的總酚、總黃酮等化合物，是中醫(yī)常用來止血、散腫毒的傳統(tǒng)藥物[14-15]；同時研究發(fā)現(xiàn)圓柏葉提取物制備的生物功能銀納米顆粒對肺癌細胞有抗轉(zhuǎn)移和抗增殖的作用[16]。此外，刺柏屬植物還具有耐寒耐旱及改善土壤環(huán)境等特點，是我國西北干旱以及被重金屬污染地區(qū)的主要栽培樹種[17-18]。刺柏屬植物在多個領(lǐng)域都有開發(fā)利用價值，因此加強刺柏屬葉綠體基因組的基礎(chǔ)研究對其高效利用具有重要意義。本研究分析了4種刺柏屬葉綠體基因組密碼子使用模式并通過外類群聚類分析驗證，確定了影響其密碼子使用偏好性的因素以及最優(yōu)密碼子，為4種刺柏屬植物葉綠體基因組后續(xù)進行異源基因表達載體設(shè)計和基因工程應(yīng)用和研究提供理論依據(jù)。

1 材料

所用的植物樣本采于云南省昆明市（102°10'E，24°23'N，平均海拔1891 m）西南林業(yè)大學(xué)（圓柏、昆明柏、鋪地柏，2020年7月3日）和中國科學(xué)院昆明植物研究所（垂枝香柏，2020年7月11日），所有樣本均由西南林業(yè)大學(xué)劉江華副教授分別鑒定柏科刺柏屬植物圓柏L.、垂枝香柏W. C. Cheng ex Ferré、昆明柏W. C. Cheng和鋪地柏(Endlicher) Siebold ex Miquel。樣本送至安諾優(yōu)達基因科技（北京）有限公司進行葉綠體基因組測序并將測序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/），圓柏、昆明柏、垂枝香柏、鋪地柏登錄號分別為MZ151419、MZ151420、MZ151421、MZ151422。

2 方法

2.1 數(shù)據(jù)處理方法

剔除CDS中基因長度小于300 bp、重復(fù)和不完整的序列，選擇起始密碼子為ATG、終止密碼子為TAA、TAG、TGA的序列，對符合條件的CDS進行下一步的分析。以4種刺柏屬植物篩選得到的CDS序列進行分析，使用CodonW1.4.2、CUSP、SPSS26.0、Excel、CUSP（http://imed.med.ucm.es/ EMBOSS/）等軟件進行數(shù)據(jù)分析以及圖表繪制。

2.1.1 ENC-plot繪圖分析 以GC3為橫坐標(biāo)（），有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）值為縱坐標(biāo)（），繪制散點圖和ENC值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（ENC＝2＋GC3＋29/[GC32＋(1－GC3)2]）。若基因落點位于標(biāo)準(zhǔn)曲線上或附近表明密碼子偏好主要受突變影響，反之則主要受到選擇影響。同時為了更準(zhǔn)確地評估觀察值（ENCobs）與期待值（ENCexp）之間的差異，根據(jù)公式（ENCexp－ENCobs）/ENCexp計算ENC的比值頻數(shù)，并結(jié)合比值頻數(shù)對差異進行量化分析。

2.1.2 PR2-plot分析 以G3/(G3＋C3)為橫坐標(biāo)（），以A3/(A3＋T3)為縱坐標(biāo)（），繪制散點圖，圖中心點位置表明堿基含量A＝T、G＝C，即密碼子不具有偏好性，其余點與中心點的矢量距離則代表其偏倚程度和方向。

2.1.3 中性繪圖分析 以GC3為橫坐標(biāo)（），GC12（GC1、GC2的平均值）為縱坐標(biāo)（），繪制散點圖并做直線擬合分析。若直線斜率接近1，表明密碼子在堿基組成上無差異，則密碼子偏好性主要決定因素為突變；若直線斜率接近0，則更多地受到選擇的影響。

2.2 高表達基因庫和低表達基因庫

以密碼子的ENC值作為偏好性參考的重要指標(biāo)，選取升序排列后的ENC值的前后兩端10%的基因，并依此建立高、低表達基因庫。根據(jù)CodonW軟件計算2個表達庫中密碼子的相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，）值和RSCU值（RSCU＝RSCU高表達－RSCU低表達），確定4種刺柏屬植物葉綠體基因組的高表達密碼子（RSCU＞1）和高頻密碼子（?RSCU≥0.08），同時滿足2個條件的密碼子為最優(yōu)密碼子。

2.3 密碼子偏性驗證分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥L.、香子含笑L.、杉木L.的葉綠體基因組序列，在4種刺柏屬葉綠體基因組基礎(chǔ)上篩選相同基因的CDS并計算密碼子的RSCU值，進行外類群聚類分析，以此來驗證4種刺柏屬葉綠體基因組密碼子偏好性。

3 結(jié)果與分析

3.1 密碼子組成特征分析

通過CodonW1.4.2和在線CUSP程序?qū)A柏（MZ151419）、昆明柏（MZ151420）、垂枝香柏（MZ151421）、鋪地柏（MZ151422）葉綠體基因組進行分析（表1）。對密碼子各位置的GC含量和ENC值進行相關(guān)性分析（表2），并對4種刺柏屬葉綠體基因組密碼子參數(shù)分析（表3）。結(jié)果表明GCall和GC1、GC2、GC3的相關(guān)性均達到極顯著水平（0.543～0.774）；GC3與GC1、GC2的相關(guān)性不顯著，但與GCall（0.543～0.743）和ENC（0.391～0.552）呈顯著相關(guān)性，說明密碼子的第3位與第1、2位的堿基組成不同。

表1 4種刺柏屬植物葉綠體基因組

表2 4種刺柏屬植物葉綠體基因的GC含量及ENC值

表3 4種刺柏屬葉綠體基因組密碼子參數(shù)的相關(guān)性分析

*< 0.05**< 0.01

3.2 密碼子偏好性影響因素分析

3.2.1 ENC-plot分析 通過對葉綠體基因組中各基因的ENC值和GC3的關(guān)聯(lián)分析，然后根據(jù)各基因與標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離來衡量影響密碼子偏好性的主要因素。落點位于標(biāo)準(zhǔn)曲線上或附近表明密碼子偏好性主要受突變影響，反之則主要受到選擇影響。

根據(jù)ENC-plot分析圖（圖1），大部分落點位于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，極少部分位于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠位置。ENC值在31.65～59.39，且絕大部分ENC值大于45，說明這4種刺柏屬植物葉綠體基因組密碼子偏好性均較弱。結(jié)合ENC比值頻數(shù)分布表（表4）發(fā)現(xiàn)，4種刺柏屬葉綠體基因組分別有14、16、17、14個基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，分別有15、22、25、23個基因距標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠，表明突變影響了密碼子的使用模式。

3.2.2 PR2-plot分析 以G3/(G3＋C3)為橫坐標(biāo)，A3/(A3＋T3)為縱坐標(biāo)進行PR2-plot分析來研究葉綠體基因組密碼子的第3位上（A/T）與（C/G）之間的關(guān)系。結(jié)果表明在4個區(qū)域內(nèi)的點分布并不均勻（圖2）。4種刺柏屬植物的點都集中在右半部分，這說明堿基使用情況T＞A，G＞C。結(jié)果表明4個刺柏屬葉綠體基因組密碼子在第3位上A/T的使用頻率較高，且密碼子使用模式受到多種因素的影響。

圖1 ENC-plot分析圖

表4 ENC比值頻率分布

圖2 PR2-plot分析

3.2.3 中性繪圖分析 本研究對4種刺柏屬植物葉綠體基因組做中性繪圖分析以進一步確定影響其密碼子偏好性的因素。以GC3為橫坐標(biāo)（），GC12為縱坐標(biāo)（）繪制散點圖。若基因落點沿對角線分布，斜率接近1，則3個位置上的密碼子堿基組成無明顯差異，密碼子偏好性主要受突變影響，反之則為自然選擇影響。

如圖3所示，4個葉綠體基因組密碼子的GC12值在0.33～0.52，GC3值在0.15～0.39，斜率在0.010～0.049，相關(guān)性不顯著，說明密碼子1、2位堿基和第3位堿基的組成存在明顯差異，密碼子的偏好性受自然選擇影響較大，這與ENC-plot分析結(jié)果一致。

圖3 中性繪圖分析

3.3 最優(yōu)密碼子確定

通過構(gòu)建高表達、低表達基因庫，分別計算4種刺柏屬植物在這2個基因庫中的RSCU和?RSCU，見表5。選取RSCU＞1的密碼子為高頻密碼子，?RSCU≥0.08的密碼子為高表達密碼子。同時滿足高頻、高表達的密碼子選為最優(yōu)密碼子。結(jié)果表明（表6），這4個刺柏屬葉綠體基因組中以G結(jié)尾的最優(yōu)密碼子只占極小部分，以A和U結(jié)尾的密碼子占絕大部分，其中又以U結(jié)尾的密碼子數(shù)最多。

表5 4種刺柏屬植物葉綠體基因組密碼子RSCU值

3.4 外類群聚類分析

為驗證本研究中所得出的4種刺柏屬葉綠體基因組密碼子的使用偏性能否用于后續(xù)對密碼子的研究，使用擬南芥（NC-000932.1）、香子含笑（MW470947）、杉木（KC427270.1）公開發(fā)表的葉綠體基因組數(shù)據(jù)篩選相同基因，計算密碼子的RSCU值（表7），根據(jù)RSCU值做聚類分析。結(jié)果表明（圖4），7個物種可以分為3大類：擬南芥、香子含笑和針葉樹種。其中鋪地柏單獨聚為1支，表明鋪地柏與其他3種刺柏屬植物密碼子使用模式具有明顯的差異。

4 討論

通常密碼子第3位堿基受到的自然選擇壓力較小，不會影響與氨基酸的對應(yīng)關(guān)系，因此對研究密碼子偏好性具有重要意義[19]。對4種刺柏屬植物葉綠體基因組進行相關(guān)性分析、中性繪圖分析，結(jié)果顯示GC3和GC1、GC2相關(guān)性不顯著，且GC3＜GC1、GC2，表明密碼子GC3與GC1、GC2有差異，且密碼子偏向以A/G堿基結(jié)尾，這與巴山松[20]、臭柏[21]等大部分裸子植物葉綠體基因組密碼子偏好性的研究結(jié)論相似，表明親緣關(guān)系近的高等植物密碼子偏好使用模式具有一定的相似性。

表6 4種刺柏屬植物葉綠體基因組最優(yōu)密碼子

*＜0.05 **＜0.01 ***＜0.001

表7 7個物種葉綠體基因組密碼子RSCU值

續(xù)表7

圖4 外類群聚類分析圖

影響密碼子偏好性形成的因素有很多，這其中最主要的因素是自然選擇和突變[22]。根據(jù)ENC-plot分析、PR2-plot分析的結(jié)果顯示4種刺柏屬植物葉綠體基因組密碼子的使用頻率T＞A、G＞C，說明影響密碼子偏好性形成的主要因素是自然選擇，這與馬尾松[23]、思茅松[24]等針葉樹種的結(jié)論一致；但與杜梨[25]、銀白楊[26]等主要受到突變影響以及巨桉[27]、芒果[28]等受突變和自然選擇的影響相對均衡的結(jié)論不一致，推測可能存在多種因素影響植物密碼子偏好性，不同物種間影響密碼子偏好性的主要因素也有所不同[29]。

利用與外類群葉綠體基因組密碼子的RSCU值進行聚類分析來對4種刺柏屬植物葉綠體基因組密碼子的使用偏性結(jié)果進行群體驗證。結(jié)果顯示，4種刺柏屬植物中鋪地柏單獨聚為1支；昆明柏、圓柏、垂枝香柏聚為另外1支。鋪地柏原產(chǎn)于日本，為匍匐灌木；垂枝香柏和昆明柏是中國特有種，為喬木或小喬木；圓柏雖分布廣泛，但屬于喬木[30]。研究結(jié)果與4種刺柏屬植物的地理分布及形態(tài)學(xué)特征一致，證明本研究中4種刺柏屬植物的密碼子偏好性分析的結(jié)果可用于后續(xù)對異源基因表達載體的設(shè)計和基因工程的應(yīng)用和研究中。

本研究在4種刺柏屬植物葉綠體基因組密碼子中篩選出共65個最優(yōu)密碼子，確定了GUA、UCU、CCU、CCA、GCU、AAA、GAU、CGU、GGA等9個密碼子為4種刺柏屬葉綠體基因組共有最優(yōu)密碼子，大部分最優(yōu)密碼子以A或U結(jié)尾，尤其以U結(jié)尾，這與杉木[31]、云南藍果樹[32]、梧桐[33]等高等植物研究結(jié)果類似，說明高等植物葉綠體基因組的進化相對保守。

本研究對4個刺柏屬葉綠體基因組密碼子的特征及偏性進行了分析和驗證，找出最優(yōu)密碼子，對制定密碼子優(yōu)化策略來提高異源蛋白在刺柏屬植物中的表達量從而改良刺柏屬植物重要性狀奠定堅實基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of codon bias in the chloroplast genome of four medicinal plants of

SHU Jun-xia1, YANG Lin1, ZHOU Tao1, SHEN Lian-wen2, WANG Da-wei1

1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China 2. Key Lab of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Mountain Forest Resources in Southwest China, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China

To determine the codon usage preference of the chloroplast genome of four medicinal plants ofgenus (,,, and) and the factors that affecting its codon preference.CodonW, CUSP, SPSS and other software was used to analyze the codon preference of the chloroplast genome of four medicinal plants of.The GC content of the chloroplast genome codons of the four medicinal plants ofwas from 35.8% to 37.3%, and the effective number of codon (ENC) value was from 47.10 to 47.79, indicating that their codon preference was weak. Neutral plotting, ENC-plot, PR2-plot analysis showed that the factors affecting the codon usage bias of the chloroplast genome of the four medicinal plants ofspecies were selection and mutation. At the same time, the relative synonymous codon usage (RSCU) value and ENC value were used to filter out a total of 65 optimal codons, of which nine codons are the optimal codons shared by four species of.The codon preference of four species ofspecies uses A/T ending, and its codon usage bias is mainly affected by natural selection. This study analyzes the codon usage bias of the chloroplast genome of four species ofplants and verified it by cluster analysis of the outer group cluster analysis, revealing the main factors affecting the codon usage bias ofgenus, and it is the foreign protein of the subsequentchloroplast genome. The construction and optimization of expression vectors provide a theoretical basis.

L.;L.;W. C. Cheng ex Ferré;W. C. Cheng;(Endlicher) Siebold ex Miquel; codon preference; optimal codon; natural selection

R286.12

A

0253 - 2670(2022)23 - 7507 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.022

2022-03-01

云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項目（201903611）

舒軍霞（1998—），女，碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種。Tel: 18008713477 E-mail: shujunxia@swfu.edu.cn

通信作者：王大瑋，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向為林木遺傳育種。Tel: 13888915161 E-mail: wangdawei@swfu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]