朱磊，陳蕓華，胡禧熙，李新月，戰(zhàn)川，呂珊珊

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319; 2. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319; 3. 黑龍江省農(nóng)科院大慶分院，黑龍江大慶 163319）

葡萄果實風(fēng)味是衡量葡萄品質(zhì)的重要指標，受糖酸組分、芳香物質(zhì)、單寧、醇、酯類等多種成分的綜合影響，其中有機酸的含量和組成是衡量葡萄成熟度及釀酒品質(zhì)的主要參數(shù)[1]。葡萄果實發(fā)育和葡萄酒發(fā)酵過程中會合成多種有機酸，這些有機酸的種類和含量會影響酒的生物穩(wěn)定性、風(fēng)味品質(zhì)和陳釀潛力[2-3]。自上世紀50年代以來，大多是關(guān)于葡萄有機酸含量及影響因素的研究報道，而有關(guān)有機酸的運載與合成代謝機理的研究報道十分有限。本文從葡萄有機酸的含量和組成出發(fā)，綜述了近年來國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于葡萄有機酸的研究進展，重點介紹了葡萄有機酸的合成，提出了未來的研究方向、思路和問題，以期為葡萄有機酸的研究提供一定參考。

1 葡萄中的主要有機酸

無機酸和有機酸是果實中的兩類酸，其中無機酸的總含量約0.1～1 g·L-1，源于植物根系從土壤中獲取的硫酸、鹽酸等無機酸類，以酒石酸、蘋果酸和檸檬酸等為代表的有機酸類則由植物自身合成[4]。在葡萄成熟過程中，果實組織中的有機酸參與三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），同時也會受到糖酵解、糖原異生、光合作用和呼吸作用等代謝基質(zhì)的影響[5]。根據(jù)碳架來源，蘋果酸、酒石酸和檸檬酸屬于脂肪族羧酸中的二元羧酸[6]（圖1）。一般而言，一種果實以一種或兩種有機酸為主，其他有機酸影響甚微[7]。葡萄果實中酒石酸含量占總酸的42.8%～77.0%，是典型的酒石酸型果實，其次是蘋果酸，占總酸的10.3%～41.6%[8-9]。雖然蘋果酸和酒石酸具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但二者合成途徑不同，蘋果酸是通過糖酵解和TCA循環(huán)生成，而酒石酸則是抗壞血酸代謝的產(chǎn)物。

圖1 葡萄果實中主要有機酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical structure formula of main organic acids in grape fruit

1.1 酒石酸

酒石酸（Tartaric acid，TA）分子式為C4H6O6，具有3種異構(gòu)體，在植物中通常以L(+)-TA存在。葡萄中酒石酸的含量較其他有機酸多，酸感也較漿果中其他有機酸更濃烈，同等濃度下酒石酸酸味約為檸檬酸的1.2～1.3倍[10]，其比例控制對于釀酒師來說具有非凡的挑戰(zhàn)性。葡萄中的酒石酸不像蘋果酸那樣能通過呼吸作用被葡萄漿果細胞代謝，在整個成熟過程中保持相對穩(wěn)定，而成熟期酒石酸濃度的下降主要是由于果實體積的增大產(chǎn)生的稀釋作用造成[11]。漿果發(fā)育早期，酒石酸能夠快速合成四碳有機酸，在酒精發(fā)酵過程中會與其他酸發(fā)生代謝反應(yīng)，或者生成新的有機酸，幫助有機酸與鹽平衡充當有效緩沖劑，酒石酸賦予葡萄酒獨特風(fēng)味和較低pH值，在釀酒過程中既對微生物有抑制作用，同時又能平衡味覺上的酸甜感以及視覺的色澤美感[12]。

1.2 蘋果酸

蘋果酸（Malic acid，MA）的分子式為C4H6O5，包含3種異構(gòu)體，植物中通常以L-蘋果酸的形式存在。葡萄果實中的蘋果酸受生理環(huán)境因素影響較酒石酸大，穩(wěn)定性較酒石酸差。相關(guān)研究表明，漿果成熟階段溫度越高，蘋果酸含量越低，而成熟階段的高溫對酒石酸影響較小[13-15]。蘋果酸味感尖酸生硬，但與檸檬酸相比酸度更低，酸感圓潤，對味蕾的刺激漸緩，回味悠長持久，若將蘋果酸與檸檬酸二者混合，不僅能削弱檸檬酸的尖銳感，而且可增加蘋果酸的味蕾興奮感，二者差異互補，呈現(xiàn)出渾厚強烈的天然果實風(fēng)味。但高含量的蘋果酸會使葡萄酒帶有突出的酸澀感，類似于未成熟的蘋果味道[16]，甚至可能引發(fā)葡萄酒瓶內(nèi)發(fā)酵，使葡萄酒的品質(zhì)下降甚至酸敗。

1.3 檸檬酸

檸檬酸（Citric acid，CA）分子式為C6H8O7，無異構(gòu)體，在葡萄的各個發(fā)育階段檸檬酸都是葡萄果實中常見的有機酸組分，但葡萄中檸檬酸的含量僅占總酸的0.02%～0.03%[17]。檸檬酸的酸味朦朧新鮮，可與其他有機酸互補平衡葡萄酒的糖酸比，使葡萄酒清新爽口，它在葡萄漿果細胞代謝、細菌和酵母的生化過程中起著關(guān)鍵作用。

1.4 葡萄果實中有機酸的含量和組成

葡萄有機酸含量隨果實的生長發(fā)育而變化，在葡萄整個生長發(fā)育過程中，酒石酸和蘋果酸含量變化總趨勢一致，即都呈先升高后降低的趨勢[18-19]。崔婧等[20]對同一產(chǎn)地不同葡萄品種各發(fā)育階段的有機酸進行變化分析，結(jié)果顯示各品種間有機酸含量變化類似，即酒石酸含量在轉(zhuǎn)色期達到峰值，蘋果酸在轉(zhuǎn)色期之前逐漸積累，轉(zhuǎn)入成熟期后迅速下降，且下降速度比酒石酸大。裴英豪等[21]對‘赤霞珠’葡萄的研究表明，酒石酸含量呈先上升后下降的趨勢，盛花期后30 d果實酒石酸快速積累，直至轉(zhuǎn)色期時轉(zhuǎn)而下降，葡萄完全轉(zhuǎn)色后酒石酸含量的變化規(guī)律不明顯，所以葡萄果實中酒石酸主要在花后30 d至轉(zhuǎn)色期這段時間累積。檸檬酸在整個果實發(fā)育階段呈下降趨勢，尤其是到成熟期時檸檬酸含量快速降低[22]。

同一果實不同部位以及同穗果實不同果粒之間的有機酸分布不均一，果皮中有機酸含量較多，而葡萄籽中有機酸含量相對較少[23]。研究發(fā)現(xiàn)，同一穗葡萄的果粒之間有機酸含量差異明顯，小果粒酒石酸和蘋果酸的含量分別為5.88～10.20 mg和0.82～1.79 mg，大果粒酒石酸和蘋果酸的含量分別為8.29～17.90 mg和0.82～3.92 mg[24]，導(dǎo)致這一差異性原因可能與果實所處的微環(huán)境有關(guān)。

不同葡萄品種的酸度存在差異，尤其是酒石酸和蘋果酸的比例差異很大，這與蘋果酸和酒石酸合成代謝中碳的流向改變有關(guān)[25-26]。Aubert等[27]對產(chǎn)于法國的‘無核白雞心’和‘玫瑰香’等6個鮮食葡萄品種的研究發(fā)現(xiàn)，果實中的酒石酸和蘋果酸分別占總酸含量的66.15%～78.48%和23.08%～37.17%。成冰[28]等人的研究結(jié)果得出了更顯著的差異，歐亞種‘白比諾’葡萄的酒石酸和蘋果酸分別占總酸的54.63%和44.62%，而歐美雜交種‘巴柯’（Bacco Noir）的酒石酸含量僅占總酸的9.25%，蘋果酸占比卻達到了81.77%。

2 主要有機酸的生物合成

2.1 酒石酸的合成

2.1.1 酒石酸合成的兩個階段

抗壞血酸（Asc）是酒石酸合成的前體[29]，合成途徑以Asc為橋梁前后銜接（圖2）。葡萄酒石酸合成的前期階段為葡萄Asc的合成，Asc含量在花后35～45 d快速積累，之后緩慢降低，直到花后60～65 d時又逐漸升高，完全成熟時達到最大值[30]。在植物細胞組織中已報道的Asc合成途徑中，除人們熟知的L-半乳糖途徑（L-galactose pathway）外，還包括6-磷酸葡萄糖在一系列酶水解、氧化作用下生成Asc的糖醛酸轉(zhuǎn)變途徑，D-半乳糖經(jīng)L-半乳糖內(nèi)酯等多個中間物質(zhì)形成Asc的碳鏈倒位途徑以及D-葡萄糖經(jīng)中間物質(zhì)D-葡萄糖醛酮和L-山梨糖醛酮生成Asc的鄰?fù)┨峭緩降萚31-33]，對這些途徑的研究雖取得了一定進展，但其合成調(diào)控機制尚未完全明晰，還需進一步深入探究。Wheeler等[34]認為，L-半乳糖途徑是植物Asc合成的主要途徑，葡萄糖經(jīng)過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化成L-半乳糖，再通過L-半乳糖酸脫氫酶（GaIDH)和L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（GaILDH）的催化生成Asc[35]（圖2）。而且高光脅迫能夠提高該途徑中L-半乳糖磷酸化酶（GGP）基因的表達量[36]，現(xiàn)已證實光照是酒石酸合成的必要前提，其穩(wěn)定性較蘋果酸強，充分的陽光照射有利于果實中的酒石酸含量達到最高水平[37]，這也說明L-半乳糖途徑在酒石酸的合成過程中起著重要作用。植物Asc多集中于果實和葉片，高等植物Asc的合成途徑會因植物果實生長發(fā)育進程而有差異[38]。在葡萄中，L-半乳糖途徑負責(zé)幼果Asc積累，成熟漿果中Asc積累主要與D-半乳糖醛酸途徑有關(guān)[39]，因此，果實的Asc水平可能由多種途徑交叉控制。

圖2 葡萄有機酸合成途徑Figure 2 Grape organic acid synthesis pathway

葡萄酒石酸合成的后期階段是葡萄Asc合成酒石酸的過程，Asc在C4/C5位點裂解，隨后通過一個或幾個未明確的反應(yīng)步驟轉(zhuǎn)化為2-酮-L-古洛糖酸，之后經(jīng)還原和氧化生成L-艾杜糖酸和5-酮-D-葡萄糖酸，再經(jīng)過一個未知酶將這個6碳化合物裂解成4碳中間體。該4碳中間體可能是酒石酸半醛，最后經(jīng)氧化生成酒石酸[40]，關(guān)于酒石酸合成的相關(guān)酶尚不確定，需進一步驗證。

2.1.2 L-半乳糖途徑的相關(guān)酶及其基因

葡萄Asc的合成階段，可以通過L-半乳糖途徑中關(guān)鍵酶基因來調(diào)節(jié)植物Asc的含量，雖然在其他植物中有很多關(guān)于L-半乳糖途徑關(guān)鍵酶基因的報道，但在葡萄中少見。該途徑中的GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP，VTC1）和GDP-D-甘露糖-3',5'-差向異構(gòu)酶（GME）不僅參與Asc的合成，而且還參與蛋白質(zhì)糖基化進行糖蛋白的合成以及細胞壁的多糖合成[41]，其編碼基因已在多個植物中得到克隆和功能驗證。Botella等[42]研究發(fā)現(xiàn)，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因（VvGMPase）在葡萄葉片中高表達，而且在果實發(fā)育成熟過程中VvGMPase的表達量保持在相同水平。GME位于GMP下游，被認為是Asc生物合成的中心酶，它可以根據(jù)細胞的氧化還原狀態(tài)和應(yīng)激條件控制Asc合成的碳通量[43]。GME對于植物Asc的積累以及細胞壁的生物合成具有重要意義，該酶的功能作用在眾多高等植物中已證實[44]。葡萄果肉中GME基因的mRNA水平始終低于整個漿果，GME基因主要集中在葡萄綠果期表達，在其他發(fā)育階段表達下調(diào)，該基因編碼的酶在L-半乳糖途徑的控制中發(fā)揮重要作用[45-46]。

通過調(diào)控GGP基因的表達能夠提高植物Asc含量。Bulley等[47]運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)將獼猴桃GGP基因轉(zhuǎn)入到番茄、草莓、擬南芥等多個植物中，發(fā)現(xiàn)該基因的過表達使不同番茄品種的Asc含量增加了3～6倍，所有草莓品種的Asc含量都增加了2倍，轉(zhuǎn)入擬南芥后Asc含量提高了4倍。Wang等[48]也報道了番茄GGP基因在煙草中的過表達使Asc含量顯著增加。由此推測，GGP可能是植物Asc生物合成的關(guān)鍵限速酶，GGP基因可能是Asc合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因。

GaILDH以細胞色素C作為特定的電子受體，是L-半乳糖途徑合成Asc的最后一個酶，其活性和轉(zhuǎn)錄水平直接決定了Asc含量，對L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯具有高度特異性，能夠迅速將外源性L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為Asc[49]。VvGaILDH的表達量在葡萄成熟過程中不斷增加，且在葡萄果肉和整個漿果中的表達水平近似[42]。植物果實Asc含量的增加可以通過增加GaILDH的表達來實現(xiàn)，該現(xiàn)象在蘋果[50]、草莓[51]中都已證實。另外，L-GaILDH基因沉默也會影響番茄中Asc含量和果實發(fā)育[52]，這些事實表明L-GaILDH在Asc生物合成中起著關(guān)鍵作用。

在上述的相關(guān)酶中，GME、GGP和GaILDH被普遍認為是L-半乳糖途徑的三個關(guān)鍵調(diào)控酶[53]。編碼GME、GMP、GaILDH和GGP的基因表達水平與果實發(fā)育過程中Asc含量顯著正相關(guān)，表明這些參與Asc生物合成的基因協(xié)同調(diào)控果實中Asc的積累。

2.1.3 酒石酸合成后期階段的相關(guān)酶及其基因

關(guān)于Asc在C4/C5位點裂解成酒石酸中間產(chǎn)物的研究結(jié)論在20多年前就已被確定[54-55]，但有關(guān)葡萄酒石酸生物合成途徑中起作用的酶及其基因則知之甚少，尤其是葡萄酒石酸合成途徑中轉(zhuǎn)酮醇酶和酒石酸半醛脫氫酶的功能尚不明確。綜合前人研究結(jié)果推測，從Asc到酒石酸主要由2-酮-L-古洛糖酸還原酶（2-KGR）、L-艾杜糖酸脫氫酶（L-IDH）、轉(zhuǎn)酮醇酶（TK）以及酒石酸半醛脫氫酶（TSDH）催化完成（圖2）。其中，L-艾杜糖酸氧化為5-酮-D-葡萄糖酸是該途徑中的限速步驟，L-IDH是該步驟的關(guān)鍵限速酶[56]。研究表明，酒石酸合成途徑中的關(guān)鍵限速酶L-IDH在開花后35 d大量積累，隨后迅速下降并維持在一定水平，L-IDH調(diào)控著酒石酸的生物合成，成熟漿果酸度的下降與編碼L-IDH的基因下調(diào)相關(guān)[57]。在葡萄中已發(fā)現(xiàn)3個L-IDH基因，它們都位于16號染色體上，但只有VvLIDH3基因被證實能氧化L-艾杜糖酸，而VvLIDH1和VvLIDH3轉(zhuǎn)錄本均在幼果期優(yōu)先表達，這可能與某些品種的季節(jié)性相關(guān)[58]。

雖然在多項研究中已證實L-IDH是目前酒石酸合成途徑中明確的關(guān)鍵酶，但Cholet等[59]認為酒石酸合成途徑中的關(guān)鍵酶可能不止L-IDH，它也可能與其他相關(guān)酶協(xié)同發(fā)揮作用。

Jia等[60]從葡萄屬中初步鑒定了醛酮還原酶Vv2KGR具有2-KGR活性，該酶對乙醛酸具有高效催化作用，Vv2KGR在1.58A分辨率下的X射線晶體結(jié)構(gòu)也表明，2-KGR與Vv2KGR結(jié)合的預(yù)測自由能最低，以此判斷Vv2KGR參與了酒石酸的生物合成。但對2-KGR酶活性的體外研究表明，2-KGR具有廣泛的底物活性，2-KGR可能還參與L-酒石酸之外的其他氧化還原反應(yīng)[61]。然而酒石酸下游合成途徑（TK將5-酮-D-葡萄糖酸轉(zhuǎn)化成TSDH，再經(jīng)過TSDH催化最終生成酒石酸）的研究甚少。在人類的基因組中，目前已經(jīng)鑒定出了一個轉(zhuǎn)酮酶（TKT）和兩個TK相似基因，分別是TKTL1和TKTL2[62]。靳靜晨等[63]根據(jù)煙草轉(zhuǎn)酮醇酶基因序列設(shè)計引物，通過RT-PCR克隆了珊西煙的TK，并將其命名為NtTK，該基因全長2235 bp，編碼744個氨基酸，與已報道的煙草TK基因核酸序列同源性達99%。

酒石酸的初級代謝雖有一定突破，但關(guān)于調(diào)控酒石酸合成代謝的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然任重道遠，因此系統(tǒng)深入地探究酒石酸生物合成的調(diào)控機制，能夠為今后生產(chǎn)過程中有目的地控制葡萄酒石酸的含量提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

2.2 葡萄蘋果酸以及檸檬酸的生物合成

TCA循環(huán)是植物蘋果酸、檸檬酸、草酰乙酸等有機酸合成的重要途徑，該途徑將各有機酸之間緊密聯(lián)系。植物果實中的蘋果酸可以通過植物的根、葉轉(zhuǎn)運輸送以及果實本身的光合作用進行合成，參與眾多細胞功能。蘋果酸從液泡中釋放出來，再通過各種途徑進行分解代謝，包括TCA循環(huán)、糖異生、氨基酸轉(zhuǎn)化、乙醇發(fā)酵以及復(fù)雜的次級化合物的合成[64-65]。葡萄中的蘋果酸是由糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸進入TCA循環(huán)轉(zhuǎn)化而來[66]，而檸檬酸的合成起源于磷酸烯醇式丙酮酸，經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和蘋果酸脫氫酶（MDH）催化獲得草酰乙酸（OAA）和蘋果酸，OAA和蘋果酸經(jīng)TCA循環(huán)獲得檸檬酸[67]。

長期以來，在果實蘋果酸和檸檬酸合成代謝途徑中的酶及編碼基因都備受關(guān)注，其中PEPC、MDH和CS是蘋果酸和檸檬酸合成代謝的3個關(guān)鍵酶[68]。蘋果酸在葡萄漿果中的持續(xù)積累主要是由于PEPC與MDH的聯(lián)合驅(qū)動，PEPC是一類常見的胞質(zhì)酶，在植物碳代謝、果實有機酸運輸方面發(fā)揮重要作用[69]，從目前對PEPC基因的研究中能夠看到PEPC在葡萄[70]、玉米[71]等相關(guān)植物中都有鑒定。Sun等[72]從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了與有機酸生物合成途徑有關(guān)的基因，將這些序列用于葡萄果實同源基因的尋找，在葡萄果實中鑒定出2個PEPC編碼基因和2個MDH編碼基因。PEPC在葡萄果實不同發(fā)育階段具有表達差異性，漿果發(fā)育早期PEPC積累較高，直到成熟后期PEPC積累有所下降[73]，這表明PEPC調(diào)節(jié)控制整個漿果發(fā)育過程中蘋果酸合成與代謝。MDH在線粒體中催化蘋果酸發(fā)生氧化反應(yīng)促進OAA生成，同時也可以將OAA轉(zhuǎn)化成蘋果酸完成TCA循環(huán)，MDH基因在葡萄[74]、竹科[75]等植物中均已得到相關(guān)鑒定。MDH在葡萄成熟過程中表達，蘋果酸濃度的降低與其編碼基因表達的減少有關(guān)，同時，高溫對MDH表達具有抑制作用[76]。檸檬酸不僅作為線粒體內(nèi)TCA循環(huán)的底物，而且還是線粒體外輔助乙酰輔酶A合成的乙酰供體，CS是檸檬酸代謝的關(guān)鍵酶，其研究主要集中在水果的生長和發(fā)育上[77]，在甜橙[78]、梅[79]等果實中報道CS對檸檬酸的合成具有積極作用，CS基因表達與果實中檸檬酸含量呈正相關(guān)。但對‘赤霞珠’果實研究發(fā)現(xiàn)，CS與檸檬酸的含量無關(guān)，這可能是‘赤霞珠’果實中有機酸代謝與梅、甜橙等核果類不同所致[80]。

3 展望

有機酸是衡量葡萄品質(zhì)的重要參數(shù)，葡萄有機酸合成、代謝和調(diào)控機制的研究在葡萄種植和釀造方面具有重要的理論和實際意義。綜合上述內(nèi)容對釀酒葡萄有機酸的研究提出以下展望：

（1）酒石酸受環(huán)境因素影響較蘋果酸小，熱敏性低于蘋果酸，在葡萄成熟過程中相對穩(wěn)定，作為葡萄的特征酸，酒石酸在葡萄品質(zhì)評價等方面有著舉足輕重的作用。目前蘋果酸和檸檬酸合成代謝途徑的研究相對成熟，但是酒石酸的合成代謝途徑存在諸多疑問。因此，酒石酸應(yīng)作為葡萄有機酸研究的重點。

（2）酒石酸合成前期階段的關(guān)鍵酶及結(jié)構(gòu)基因已有明確報道，但關(guān)于Asc合成酒石酸階段的關(guān)鍵酶還存在諸多爭議，例如，L-IDH是否為Asc合成酒石酸階段的唯一關(guān)鍵酶？Asc在轉(zhuǎn)化為2-酮-L-古洛糖酸的過程中經(jīng)過了怎樣的反應(yīng)步驟？除已明確的2個酶L-IDH和2-KGR參與了葡萄酒石酸合成外，如何明確轉(zhuǎn)酮醇酶和酒石酸半醛脫氫酶參與葡萄酒石酸的合成？這些方面仍需深入研究酒石酸后期合成階段的合成途徑。

（3）葡萄有機酸合成代謝途徑中涉及的基因眾多，一方面相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因功能需要進一步驗證，另一方面應(yīng)深入挖掘轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子并進行功能驗證，以期實現(xiàn)葡萄有機酸含量和組成的精準調(diào)控。

（4）目前葡萄有機酸的研究主要集中于合成調(diào)控方面，而有機酸合成后的下游代謝途徑也需要深入研究，尤其是對酒石酸的研究，從而明確有機酸含量隨漿果成熟下降的多種原因。