秦鴻楠，周 娟，李 琳，張勤文

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

低壓低氧是高原環(huán)境的基本特征之一，對機(jī)體的機(jī)能和代謝均會產(chǎn)生影響。在低氧環(huán)境中高原動物為了維持正常的生理機(jī)能，機(jī)體需動員體內(nèi)一系列的適應(yīng)機(jī)制來提高機(jī)體攝入、運(yùn)輸和利用氧氣的能力，以達(dá)到適應(yīng)高原低氧環(huán)境的目的[1]。牦牛作為高原特有的大型土著動物，大多分布于海拔3 000～5 000 m 的地區(qū)，海拔3 000 m和5 000 m的大氣氧含量僅為海平面氧含量的 73%和52%[2]，在這種低氧環(huán)境下牦牛經(jīng)過長時間的自然選擇和進(jìn)化，其在解剖、生理和生化等方面都存在適應(yīng)高原環(huán)境的可遺傳特征[3]。比如，心肺指數(shù)高、心肺發(fā)育良好是高原牦牛及其他高原土著動物的共同特點(diǎn)[4]。與平原黃牛相比，高原牦牛肺泡隔較厚，肺氣血屏障較薄，絕大部分是I型肺泡上皮且有間斷處，肺泡上皮為非連續(xù)型上皮[5-7]。陳秋生等[8]研究發(fā)現(xiàn)，高原牦牛肺臟存在良好的擴(kuò)張和收縮的原因是其肺泡隔、支氣管管壁內(nèi)有豐富且粗大的彈性纖維，并構(gòu)成完整的彈性系統(tǒng)，同時各級支氣管中杯狀細(xì)胞分泌的黏液可以有效保護(hù)呼吸道的通氣量。研究表明，不同品種平原動物進(jìn)入高原低氧環(huán)境，隨著動物肺血管平滑肌含量的增加，其對低氧的敏感程度也越高，這是形成“獸胸病”的組織學(xué)基礎(chǔ)[9]，而大通牦牛不易形成肺動脈高壓，主要是由于大通牦牛肺血管內(nèi)的平滑肌含量較平原黃牛少[10]。高原牦牛在生長發(fā)育過程中，肺氣血屏障平均厚度比同日齡的平原黃牛薄，此結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以降低肺泡的氣體交換阻力，同時有效增加氣體在肺泡中的交換速率[11]。

目前，牦牛肺低氧適應(yīng)的組織學(xué)研究大多集中在不同海拔成年牦牛的比較，牦牛肺發(fā)育學(xué)變化雖有少量報道，但缺乏系統(tǒng)性和全面性，因此，本試驗選取不同發(fā)育階段的大通牦牛和棗北黃牛作為研究對象，運(yùn)用 蘇木精-伊紅(Hhematoxylin-eosin,H.E.)染色、Verhoeff's Van Gieson(EVG)染色方法，觀測其肺組織的顯微結(jié)構(gòu)，探討大通牦牛與棗北黃牛肺組織纖維結(jié)構(gòu)的差異，從而分析大通牦牛肺組織適應(yīng)高原低氧環(huán)境的發(fā)育特點(diǎn)，為進(jìn)一步開展高原牦牛低氧適應(yīng)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選取臨床健康1日齡、30 日齡、180 日齡和成年(>600日齡)4 個年齡段的大通牦牛(海拔 3 700 m)作為研究對象，并選擇相同日齡的棗北黃牛(海拔 100 m)作為對照。

1.2 主要儀器 脫水機(jī)(Donatello)，購自DIAPATH公司；包埋機(jī)(JB-P5)、凍臺(JB-L5)，均購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)(RM2016)，購自上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機(jī)(KD-P)，購自浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；烤箱(DHG-9140A)，購自上?；厶﹥x器制造有限公司；正置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse C1)、生物顯微鏡(E100)、成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3)，均購自日本尼康公司；圖像采集系統(tǒng)(Olympus DP 70)，購自奧林巴斯(中國)有限公司。

1.3 主要試劑 無水乙醇、二甲苯、酒精蘇木素、三氯化鐵溶液、碘液、飽和苦味酸和酸性品紅，均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 試驗動物處理 所有試驗動物均于棲息地現(xiàn)場屠宰，每組各取3頭，屠宰后于右肺心葉、膈葉相同部位取樣，4% 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。采用H.E.染色法觀察肺泡和肺泡隔；采用EVG 染色法顯示彈性纖維和膠原纖維。EVG 染色法：將酒精蘇木素∶三氯化鐵∶碘液按5∶2∶2 混合成 EVG 染液(提前2 d配置)，切片入 EVG 染液染 5 min，自來水沖洗；后將飽和苦味酸∶酸性品紅按9∶1混合成VG染液進(jìn)行復(fù)染，透明封片。

1.5 觀察與測量 每張切片在Olympus DP 70圖像采集系統(tǒng)中在200倍放大倍數(shù)下選取結(jié)構(gòu)完整的5個視野進(jìn)行觀察并采集圖片。所有圖片用 Image-Pro Plus 5.1 Chinese 圖像分析系統(tǒng)測量相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.5.1 肺泡隔厚度(Mean alveolar septum thickness,MAST)測量 采用四點(diǎn)十字交叉法，按公式(1)測算線上的MAST。

(1)

式中：Tai(i=1,2,3…n)表示每個肺泡隔厚度，n表示肺泡隔的數(shù)目。

1.5.2 單位面積內(nèi)肺泡數(shù)(Mean alveolar number,MAN)測量 取光學(xué)顯微鏡拍攝圖片視野中的1個內(nèi)切矩形，將此矩形面積作為1個單位面積(S)，S=138 295.53 μm2。以數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則，按公式(2)計算MAN。

(2)

式中：Ani(i=1，2，3，…，n)為1個單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)，n表示測量圖片數(shù)目。

1.5.3 單位面積肺實質(zhì)面積/單位面積 在1個單位面積內(nèi)選取任意視野測量單位面積肺實質(zhì)面積，每一個標(biāo)本取5個視野進(jìn)行測量，取測量值的平均值，計算單位面積肺實質(zhì)面積/單位面積。

1.5.4 彈性纖維占比計算 利用光學(xué)顯微鏡觀察彈性纖維的分布情況，在1個單位面積內(nèi)選取任意視野測量肺泡壁和血管的彈性纖維面積，每一個標(biāo)本取5個視野值進(jìn)行測量，取測量值的平均值，最后分別計算二者與肺泡總面積和血管實體總面積的比值，即為肺泡壁彈性纖維占比和血管彈性纖維占比。

1.5.5 血管中膜占比計算 每張切片找至少10個血管橫切面，作經(jīng)過血管中點(diǎn)的十字交叉線，分別測量2個血管外徑(D)和4個中膜肌層厚度(t)，取其平均值，按公式(3)計算血管中膜占比。

血管中膜占比(%)=2t/D×100%

(3)

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 通過SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立t檢驗，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”來表示。以P<0.05作為差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大通牦牛和棗北黃牛肺組織H.E.染色觀察 如圖1所示，大通牦牛肺泡呈圓形或半圓形，1日齡時，大通牦牛肺泡結(jié)構(gòu)雖發(fā)育基本完善，但其肺泡大小和肺泡隔厚度不均勻(圖1A)，而棗北黃牛單位面積內(nèi)肺泡數(shù)較少，肺間質(zhì)面積占比較大(圖1E)；隨年齡增長，30日齡時，大通牦牛肺泡隔厚度較薄，但單位面積內(nèi)肺泡數(shù)、肺間質(zhì)面積占比較其余3個年齡少(圖1B)，棗北黃牛的單個肺泡面積較大，單位面積內(nèi)肺泡數(shù)較30日齡大通牦牛少(圖1F)；180日齡時，大通牦牛肺泡隔厚度增厚且分布較均勻，肺間質(zhì)面積占比增加(圖1C)，而棗北黃牛單位面積內(nèi)肺泡數(shù)減少，單個肺泡面積增大(圖1G)；成年時，大通牦牛單位面積內(nèi)肺泡數(shù)較180日齡減少，肺泡隔厚度增厚(圖1D)，而棗北黃牛單個肺泡面積較其他3個年齡明顯增大且肺泡隔厚度變薄呈線狀(圖1H)。

圖1 大通牦牛和棗北黃牛的肺組織結(jié)構(gòu)(H.E.染色，200×)

2.2 大通牦牛和棗北黃牛肺組織中彈性纖維含量的比較 如圖2所示，經(jīng)EVG染色后，肺組織中彈性纖維呈黑色，膠原纖維呈紅色，隨著年齡的增長，大通牦牛肺組織彈性纖維含量先減少后增多，而棗北黃牛肺組織彈性纖維含量不斷減少。

圖2 大通牦牛和棗北黃牛肺組織彈性纖維(EVG染色，200×)

2.3 大通牦牛和棗北黃牛MAST和MAN的比較 由表1可知，大通牦牛MAST隨年齡的增長而逐漸增厚；棗北黃牛的MAST出生時最厚，在成年時最薄；大通牦牛MAN隨年齡的增長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；與棗北黃牛相比，180日齡時，大通牦牛MAN顯著小于棗北黃牛(P<0.05)，其余3個年齡大通牦牛MAN顯著大于棗北黃牛(P<0.05)。

表1 大通牦牛和棗北黃牛肺泡隔厚度和單位面積內(nèi)肺泡數(shù)的比較

2.4 大通牦牛和棗北黃牛單位面積肺實質(zhì)面積/單位面積和肺泡壁彈性纖維占比的比較 由表2可知，隨著年齡的增長，大通牦牛單位面積肺實質(zhì)面積/單位面積先減少后增加，棗北黃牛單位面積肺實質(zhì)面積/單位面積則不斷減??；30日齡時，大通牦牛單位面積肺實質(zhì)面積/單位面積顯著小于棗北黃牛(P<0.05)，180日齡和成年時，大通牦牛單位面積肺實質(zhì)面積/單位面積顯著大于棗北黃牛(P<0.05)。隨著年齡的增長，大通牦牛肺泡壁彈性纖維占比先減少后增多再減少，在出生時其占比最高，30日齡時最低；棗北黃牛肺泡壁彈性纖維占比不斷減少；1日齡和30日齡時，大通牦牛肺泡壁彈性纖維占比顯著小于棗北黃牛(P<0.05)，成年時，大通牦牛肺泡壁彈性纖維占比顯著大于棗北黃牛(P<0.05)。

表2 大通牦牛和棗北黃牛單位面積肺實質(zhì)面積/單位面積和肺泡壁彈性纖維占比的比較

2.5 大通牦牛和棗北黃牛血管中膜占比和血管彈性纖維占比的比較 由表3可知，大通牦牛隨年齡的增加其血管中膜占比先增加后減少，且在成年時含量最低，30日齡和成年時，大通牦牛血管中膜占比顯著大于棗北黃牛(P<0.05)；大通牦牛血管彈性纖維占比隨年齡的增長呈現(xiàn)先減少后增加再減少的趨勢，且其含量在180日時齡最高，30日齡時最低，而棗北黃牛血管彈性纖維占比隨著年齡的增長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且在30日齡時含量最高，成年時含量最低，30日齡時大通牦牛血管彈性纖維占比顯著小于棗北黃牛(P<0.05)，其余3個年齡大通牦牛血管彈性纖維占比顯著大于棗北黃牛(P<0.05)。

表3 大通牦牛與棗北黃牛血管中膜占比和血管彈性纖維占比的比較

3 討論

機(jī)體對高原低氧環(huán)境的適應(yīng)，主要圍繞氧氣的攝入、運(yùn)輸和細(xì)胞的利用3個環(huán)節(jié)展開。而肺作為氣體交換的器官，其組織結(jié)構(gòu)和功能在氧氣的攝入過程中發(fā)揮重要的作用，牦牛肺組織在長期進(jìn)化過程中形成的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為保證其在高原低氧環(huán)境中有充足的氧氣攝入提供了重要的組織學(xué)保障。

肺泡隔由肺泡壁毛細(xì)血管和其周圍的肺氣血屏障構(gòu)成，本試驗表明大通牦牛肺泡隔厚度隨著年齡增長逐漸增厚，結(jié)合本課題組前期研究[9-11]得到的大通牦牛較平原黃牛有較薄的肺氣血屏障的結(jié)果，牦牛肺組織有較多的肺泡壁毛細(xì)血管是導(dǎo)致肺泡隔厚度增加的主要原因，較薄的肺氣血屏障可使肺氣體交換過程中阻力減小，較多的肺泡壁毛細(xì)血管可增加肺氣體交換速率，而本試驗結(jié)果中，隨年齡增長，180日齡時肺泡壁彈性纖維增加也是導(dǎo)致肺泡隔厚度增加的另一個原因，彈性纖維的數(shù)量增加，可增加肺泡的彈性回縮力，為肺的良好換氣提供重要保障，由于成年時大通牦牛逐漸適應(yīng)了低氧環(huán)境，因此大通牦牛的肺泡壁彈性纖維占比減少。陳秋生等[8]在成年牦牛的研究中也發(fā)現(xiàn)，牦牛肺泡隔、支氣管管壁內(nèi)都存在豐富且粗大的彈性纖維，構(gòu)成完整的彈性系統(tǒng)。其他學(xué)者在藏羊中研究也發(fā)現(xiàn)，藏羊肺泡隔厚度顯著厚于小尾寒羊，藏羊肺泡隔內(nèi)毛細(xì)血管較小尾寒羊豐富，多呈開放狀態(tài)且管徑較粗，肺泡隔內(nèi)彈性纖維粗大且數(shù)量多[12-14]，也證明了高原土著動物肺組織具有肺泡隔較厚、毛細(xì)血管較多和彈性纖維較多的特點(diǎn)。肺泡隔、支氣管管壁內(nèi)都存在有豐富的彈性纖維并構(gòu)成完整的彈性系統(tǒng)，可以使肺臟處于良好的擴(kuò)張和收縮狀態(tài)，保證肺內(nèi)氣體有效的排出。

本試驗結(jié)果顯示，在大通牦牛發(fā)育過程中，30日齡是一個相對特殊的階段，主要表現(xiàn)為此階段有較高的單位面積內(nèi)肺泡數(shù)、較低的肺泡壁彈性纖維和血管彈性纖維占比的特點(diǎn)，此結(jié)果與魏青[5]的研究結(jié)果一致，結(jié)合本課題組前期研究[5-6]，大通牦牛在30日齡肺泡進(jìn)入快速發(fā)育階段，其單位面積內(nèi)肺泡數(shù)急劇增多，這在肺切片觀察中得到證實。本試驗中，隨年齡增長，肺泡壁彈性纖維和血管彈性纖維占比的增加，導(dǎo)致肺實質(zhì)面積占比增加和單位面積內(nèi)肺泡數(shù)逐漸減少。

已有研究認(rèn)為，隨著肺血管平滑肌含量的增加，動物對于低氧的敏感程度也逐漸增加[15]。在本試驗中，大通牦牛血管中膜占比較棗北黃牛豐富，且差異顯著(P<0.05)，主要原因可能是大通牦牛肺血管內(nèi)平滑肌含量有利于動脈的射血及血液循環(huán)，更好的維持牦牛的肺血液循環(huán)量。這與靳新花等[16]報道的研究結(jié)果一致，其認(rèn)為成年牦牛肺血管內(nèi)平滑肌含量豐富。

綜上所述，與棗北黃牛相比，大通牦牛隨年齡的增長，其肺泡隔厚度增厚、肺泡壁彈性纖維占比和血管彈性纖維占比先降低后升高再降低，單位面積內(nèi)肺泡數(shù)和血管中膜占比先增加后減少。這些肺顯微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是大通牦牛適應(yīng)高原低壓低氧環(huán)境的組織學(xué)基礎(chǔ)。