王黎霞，張 鵬，張建軍，安 健

(1.北京農業(yè)職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)系，北京 房山 102442 ；2.北京農學院動物科學技術學院 國家級動物類實驗示范中心，北京 昌平 102206)

粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte macrophagocyte colony stimulating factor，GM-CSF)在集落刺激因子家族中有重要作用[1]，其能激發(fā)造血干細胞和不同類型的生血祖細胞增生和異化[2]，增強DNA疫苗對被免疫動物的保護效果[3]，提升單抗原的免疫力，增強白介素-2的生成，活化CD4+T細胞，增加抗體的分泌，同時增強CD8+T細胞活性。

人源GM-CSF和鼠源GM-CSF在畢赤酵母表達的研究報告較多[4-5]，國內外畢赤酵母表達雞重組GM-CSF(rchGM-CSF)及其活性測定的報道罕見，為此，本試驗設計PCR引物對海蘭灰蛋雞GM-CSF(chGM-CSF)基因進行序列改造，刪除N端的信號肽基因序列，選擇畢赤酵母真核表達系統(tǒng)進行rchGM-CSF的表達，利用淋巴細胞增殖試驗測定其免疫促進效果，為細胞因子佐劑的研制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 質粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒，均為Axygen公司產品；pGEM-T克隆質粒、表達質粒pPICZαA、畢赤酵母GS115，均為Promega公司產品；T4 DNA限制性內切酶EcoR I、NotI、連接酶，均為TaKaRa公司產品；羊抗鼠IgG-HRP、濃縮型DAB試劑盒、RPMI1640、淋巴細胞分離液、WST-1細胞增殖檢測試劑盒，均為碧云天公司產品；His Ab-1、鼠抗His單克隆抗體、Ni-NTA HIS·Bind Resin、Ni-NTA Buffer Kit、Chromatography Columns，均為Novagen公司產品。

1.2 方法

1.2.1chGM-CSF去信號肽的編碼區(qū)(Coding sequences,CDS)擴增 據GenBank數(shù)據庫chGM-CSF基因序列設計引物、克隆、測序，并與GenBank數(shù)據庫中chGM-CSF基因片段進行序列比對，確定為chGM-CSF基因，利用SignalP 3.0數(shù)據庫和SignalP-HMM算法預測序列的信號肽，通過Primer Premier 5.0軟件設計去信號肽的蛋白質CDS引物，預期片段大小為389 bp。上游引物：5′-CCGAATTCTACTCCTGCTGCTACAAAGT-3′，下游引物：5′-GCGGCCGCTTGGATGCAGTCTTTCTC-3′。反應體系(50 μL)：pGEX-6p-1/chGM-CSF 1 μL，10×Buffer 5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，dNTP 2 μL，滅菌超純水39.8 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃結束反應。PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果與GenBank數(shù)據庫中chGM-CSF基因比對，確定信號肽CDS是否去掉。

1.2.2 重組質粒構建、轉化JM109菌和陽性菌篩選 將chGM-CSF基因PCR產物及pPICZαA質粒用EcoR I和NotI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。將純化的片段與質粒連接，構建畢赤酵母表達質粒pPICZαA/chGM-CSF，轉化JM109菌，克隆、篩選，小量提取質粒，EcoR I、NotI酶切和PCR鑒定。

1.2.3 重組質粒電轉化畢赤酵母和陽性酵母克隆篩選 將1.2.2中篩選的陽性菌擴大培養(yǎng)，純化重組質粒pPICZαA/chGM-CSF，電轉化畢赤酵母GS115，同時，設空質粒電轉化對照組作為后續(xù)誘導表達的對照。電轉化的畢赤酵母用Zeocin抗生素篩選，對陽性單菌擴大培養(yǎng)，提取空質粒電轉化組和pPICZαA/chGM-CSF電轉化組的畢赤酵母質粒，用AOX通用引物進行PCR鑒定。

1.2.4 rchGM-CSF小規(guī)模誘導表達及鑒定 分為4個組，A組：重組質粒轉化的畢赤酵母甲醇未誘導培養(yǎng)36 h對照組；B組：未經轉化的畢赤酵母甲醇誘導培養(yǎng)2 d對照組；C組：空質粒轉化畢赤酵母甲醇誘導培養(yǎng)2 d對照組；D組：重組質粒轉化的畢赤酵母甲醇誘導1～4 d試驗組，收集各組培養(yǎng)上清，SDS-PAGE后硝酸銀染色，以抗His單抗為一抗通過Western blot鑒定rchGM-CSF的表達。

1.2.5 rchGM-CSF的大量表達及純化 大規(guī)模誘導表達rchGM-CSF，收集第3天培養(yǎng)液200 mL，離心分離上清，采用超濾法除鹽濃縮為5 mL，Ni-NTA柱純化[6]，SDS-PAGE后硝酸銀染色鑒定，并以抗His單抗為一抗進行Western blot鑒定。

1.2.6 rchGM-CSF生物活性鑒定 利用分光光度計在280 nm處對重組蛋白濃度進行測定，調整重組蛋白濃度為20 μg/mL，按1∶5、1∶25、1∶125、1∶625比例稀釋，同時設不加rchGM-CSF的細胞對照。無菌取健康雞脾臟，剪碎成1 mm3的小塊，按常規(guī)方法分離淋巴細胞[7]，調節(jié)淋巴細胞終濃度為3.0×106個/mL；取50 μL淋巴細胞懸液加入96孔細胞板中，用MTT試驗鑒定不同稀釋倍數(shù)的rchGM-CSF的生物活性[7]。

2 結果

2.1chGM-CSF去信號肽的CDS擴增 分析克隆得到的chGM-CSF基因，發(fā)現(xiàn)其具有潛在的信號肽，信號肽位于5′端的72 bp。重新設計引物，PCR得到chGM-CSF新序列長度為389 bp，與GenBank數(shù)據庫中chGM-CSF基因序列比對結果顯示，新序列在GAATTC酶切位點后缺失了72 bp，表明信號肽被成功去掉。

2.2 重組質粒構建、轉化JM109菌和陽性菌篩選 將雙酶切后回收純化的pPICZαA質粒與chGM-CSF片段連接，連接產物轉化JM109菌、篩選陽性克隆、培養(yǎng)，小量提取質粒，經PCR和酶切鑒定，結果顯示，重組表達質粒pPICZαA/chGM-CSF構建成功(圖1)。

圖1 pPICZαA/chGM-CSF的PCR鑒定(A)和雙酶切鑒定(B)

2.3 重組質粒電轉化畢赤酵母和陽性酵母克隆篩選 重組表達質粒(試驗組)和空質粒(對照組)分別電轉化畢赤酵母GS115，在含100 μg/mL Zeocin YPD固體培養(yǎng)基上篩選畢赤酵母菌落，用AOX通用引物對其進行PCR擴增并電泳鑒定，結果顯示，重組表達質粒轉化的畢赤酵母出現(xiàn)930 bp的條帶，空質粒轉化的畢赤酵母出現(xiàn)591 bp的條帶，說明篩選的畢赤酵母為陽性重組克隆(圖2)。

圖2 電轉pPICZαA對照組(A)和電轉pPICZαA/chGM-CSF試驗組(B)酵母菌落的PCR鑒定

2.4 rchGM-CSF小規(guī)模誘導表達及鑒定 收集各對照組(A組、B組和C組)和試驗組(D組)的培養(yǎng)上清，SDS-PAGE后硝酸銀染色發(fā)現(xiàn)，第1～4天D組的誘導表達的培養(yǎng)上清在20 kDa處有1條清晰的條帶，各對照組無該條帶(圖3A)，說明甲醇誘導了重組質粒轉化的畢赤酵母表達了rchGM-CSF?；叶葤呙璺治霭l(fā)現(xiàn)，第3天和第4天 rchGM-CSF表達量最多。采用Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，D組有1條20 kDa的蛋白條帶(圖3B)，說明rchGM-CSF由甲醇誘導表達成功。

圖3 培養(yǎng)上清的SDS-PAGE鑒定(A)和Western blot鑒定(B)

2.5 rchGM-CSF的大量表達及純化 分離畢赤酵母培養(yǎng)物200 mL，離心收集上清液，濃縮后Ni-NTA柱純化，純化后的rchGM-CSF經SDS-PAGE和硝酸銀染色鑒定顯示，rchGM-CSF被第2～3根柱長體積的洗脫液洗脫純化，大小為20 kDa和17 kDa(圖4A)，經Western blot鑒定，條帶大小也是20 kDa和17 kDa(圖4B)，表達量分析表明，誘導表達第3天，rchGM-CSF在上清中表達量達5 mg/L。

圖4 純化rchGM-CSF的SDS-PAGE鑒定(A)和Western blot鑒定(B)

2.6 rchGM-CSF生物活性鑒定 MTT試驗結果顯示，rchGM-CSF按1∶5稀釋與按1∶25、1∶125、1∶625稀釋及細胞對照相比，可極顯著地促進淋巴細胞增殖(P<0.01)；按1∶25稀釋與按1∶125、1∶625稀釋及細胞對照相比，可顯著地促進淋巴細胞增殖(P<0.05)。結果表明，純化的rchGM-CSF有較好的生物活性(圖5)。

圖5 MTT法鑒定rchGM-CSF生物活性

3 討論

目前，蛋白異源表達系統(tǒng)有經過改造的昆蟲細胞系、改造后大腸埃希菌工程菌、哺乳動物細胞系、酵母菌和雞柔嫩艾美耳球蟲等[8]。與原核表達系統(tǒng)相比，真核表達系統(tǒng)的優(yōu)勢是異源蛋白可進行糖基化和甲基化等的修飾[9]。本試驗利用帶有6His標簽的pPICZαA質粒，在甲醇存在時表達外源基因。rchGM-CSF可被His親和柱吸附，混雜的蛋白則不能被吸附而被洗脫，再用高濃度咪唑洗脫液將吸附柱上的His異源蛋白洗脫，在洗脫液中得到純化的rchGM-CSF。本試驗中甲醇誘導第3天的培養(yǎng)液的rchGM-CSF表達量達5 mg/L，可以滿足對rchGM-CSF的活性功能的研究，具有重要的實踐意義。

Srinivasa等研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母表達的人和小鼠等動物的GM-CSF都具有不同數(shù)量的氨基酸被糖基化，其分子量要比預測的大，SDS-PAGE和Western blot鑒定時，條帶的大小比理論值大3～5 kDa[4]。本試驗也發(fā)現(xiàn)，rchGM-CSF的分子量也有增大。經His親和柱純化后，得到的2個條帶都能與His單抗發(fā)生特異性反應，分子量較大、數(shù)量較多的條帶是糖基化的結果，分子量較小、數(shù)量較少的條帶與預期的蛋白理論大小相符，說明大部分異源蛋白都被糖基化。對小規(guī)模誘導表達的上清液進行SDS-PAGE和Western blot鑒定的結果中并沒有小條帶，可能是沒有純化濃縮的上清液中未糖基化蛋白的濃度低，沒有達到可檢出的濃度，而純化濃縮后，蛋白的濃度增大，才出現(xiàn)可見的顯色而被發(fā)現(xiàn)。

GM-CSF是一種決定性的細胞因子，參與多種免疫反應，皮膚給予GM-CSF后，注射位的表皮樹突狀細胞顯著增多，1周左右達到峰值，部分表皮樹突狀細胞還可進入皮下淋巴組織[10]。同時，GM-CSF還可顯著地增加核酸疫苗的免疫效果[11]。Dranoff等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠GM-CSF可增強抗腫瘤核酸疫苗的效力，進而減少腫瘤細胞[5]。與單獨使用痘病毒DNA相比，小鼠GM-CSF的DNA與痘病毒DNA聯(lián)合使用可明顯提升抗體滴度和IFN-γ的濃度，更進一步增強了細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte，Tc)的功能[12]。在瘧疾DNA疫苗中也發(fā)現(xiàn)了較為一致的結果[13]。GM-CSF與C型病毒性肝炎DNA聯(lián)合免疫，能顯著增強體液免疫和細胞免疫[14]。Somasundaram等研究發(fā)現(xiàn)，GM-CSF能增強偽狂犬病病毒DNA疫苗刺激機體產生更高水平的IgG1和IgG2，鼻腔排毒量顯著下降，縮短排毒時間[15]。

GM-CSF與其他細胞因子同時使用，可顯著增強DNA疫苗的免疫效果。GM-CSF、IL-2與B型肝炎病毒DNA疫苗聯(lián)合應用，可增強昆明小鼠的Thl型細胞反應，IgGl和IgG2α滴度顯著升高，通過溶細胞反應可明顯減少細胞數(shù)量[16]。豬GM-CSF與CD40聯(lián)合，可增強核酸疫苗的免疫效果，提高β-gal抗體IgG、IgG2a的水平[17]，也可促進Tc顯著增殖[18]。本試驗也發(fā)現(xiàn)，rchGM-CSF按1∶5稀釋能極顯著地促進淋巴細胞增殖，按1∶25稀釋能夠顯著地促進淋巴細胞增殖。

綜上，本試驗采用畢赤酵母作為表達系統(tǒng)工具，獲得了雞重組GM-CSF，結果表明，該異源蛋白促進了淋巴細胞增殖，說明其具備增強免疫的作用，為其作為免疫佐劑的進一步研究提供了理論支持。