李小軍，李勝利，樊帥奇，鄧翔杰，孫亞偉

(1.河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 濟(jì)源 454650；2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

沙門(mén)菌是引發(fā)食物中毒的一類重要病原菌，每年該菌導(dǎo)致全球約9 380萬(wàn)人感染，15.5萬(wàn)人死亡[1]。鼠傷寒沙門(mén)菌是沙門(mén)菌一個(gè)重要血清型，是臨床沙門(mén)菌病的主要病原。目前，治療沙門(mén)菌病的首選藥物是 β-內(nèi)酰胺類藥物和氟喹諾酮類藥物。然而，由于抗菌藥的不合理使用和誤用，多重耐藥鼠傷寒沙門(mén)菌的出現(xiàn)和廣泛傳播已使沙門(mén)菌病治療面臨更大的挑戰(zhàn)[2]。

多重耐藥泵是細(xì)胞膜內(nèi)的一類膜蛋白，它可借助ATP酶水解和細(xì)胞膜兩側(cè)的質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力，把進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物、去污劑和細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物排至細(xì)胞外。在鼠傷寒沙門(mén)菌體內(nèi)，AcrAB-TolC是最重要的多重耐藥泵之一。當(dāng)其在敏感鼠傷寒沙門(mén)菌SL1344中失活后，體外用環(huán)丙沙星不能篩選出氟喹諾酮類耐藥突變體[3]。當(dāng)其在臨床多重耐藥鼠傷寒沙門(mén)菌BN10055和543SA98中失活后，突變體對(duì)萘啶酸、環(huán)丙沙星、氯霉素、氟苯尼考和四環(huán)素的最小抑菌濃度(Minimum inhibition concentration,MIC)降低8～64倍，表型由耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)橹薪榛蛎舾衃4]。細(xì)菌多重耐藥產(chǎn)生過(guò)程中，AcrAB-TolC是組成性表達(dá)，其表達(dá)水平主要受RamRA、MarRA、SoxRS 和AcrR調(diào)控。其中，RamRA是最重要的調(diào)控體系。已證實(shí)，RamA能夠直接結(jié)合在acrA和tolC啟動(dòng)子區(qū)提高該基因表達(dá)[5]。ramR基因位于ramA基因上游，其轉(zhuǎn)錄方向與ramA基因相反。臨床鼠傷寒沙門(mén)菌中，當(dāng)RamR發(fā)生突變或RamR與外排泵底物(溴化乙錠、羅丹明6G和吲哚)結(jié)合后，RamR從ramA啟動(dòng)子區(qū)解離，RamA表達(dá)，acrAB表達(dá)水平增加，細(xì)菌對(duì)藥物敏感性下降[6-7]。AcrR是AcrAB-TolC的一個(gè)負(fù)調(diào)控蛋白，其蛋白編碼序列位于acrAB開(kāi)放閱讀框上游，轉(zhuǎn)錄方向與acrAB相反。目前，AcrR突變、缺失、轉(zhuǎn)錄提前終止，IS插入等已在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌染色體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，這些基因變化導(dǎo)致了acrAB表達(dá)水平增加，細(xì)菌對(duì)藥物敏感性下降[8-10]。盡管上述研究已證實(shí)了AcrR在臨床多重耐藥菌中的作用，然而它在沙門(mén)菌中的相關(guān)報(bào)道卻非常少。

2004年，Hsueh等從豬和人體內(nèi)分離的環(huán)丙沙星耐藥霍亂沙門(mén)菌中首次發(fā)現(xiàn)AcrR突變(Gln78Stp)，但鼠傷寒沙門(mén)菌的AcrR沒(méi)有發(fā)生變化[11]。另外，由鴿子分離的1株敏感鼠傷寒沙門(mén)菌 BN18，體外用環(huán)丙沙星篩選2株多重耐藥菌BN18/41和BN18/71，其AcrR序列在第75位異亮氨酸(Ile) 第76位谷氨酸(Glu)后出現(xiàn)1個(gè)75Ile-76Glu重復(fù)。用敏感菌BN18的acrR在該突變體內(nèi)互補(bǔ)后，麻保沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和氯霉素對(duì)細(xì)菌的MICs下降4倍[12]。目前AcrR在臨床鼠傷寒沙門(mén)菌中是否發(fā)揮作用還未見(jiàn)報(bào)道。

為了闡明臨床鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥機(jī)制，本試驗(yàn)首先檢測(cè)多重耐藥泵抑制劑在4株臨床菌對(duì)不同藥物敏感性中作用，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time RT-PCR)檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)主要多重耐藥泵基因相對(duì)表達(dá)水平；其次，失活細(xì)菌內(nèi)主要多重耐藥泵及其調(diào)控蛋白，比較蛋白失活前后細(xì)菌MICs變化，確定該蛋白在細(xì)菌多重耐藥中作用；最后，測(cè)序分析細(xì)菌耐藥相關(guān)蛋白基因序列，選取發(fā)生突變的耐藥泵相關(guān)蛋白并在臨床菌中過(guò)表達(dá)，確定該蛋白在多重耐藥調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 鼠傷寒沙門(mén)菌CVCC541(命名為ST)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；臨床鼠傷寒沙門(mén)菌CST1、CST2、CST3和 CST4，分別從不同地區(qū)不同病雞的肝臟中分離，均通過(guò)生化及PCR測(cè)序鑒定為鼠傷寒沙門(mén)菌。大腸桿菌DH5α，本實(shí)驗(yàn)室保存菌；原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a，購(gòu)自Novagen公司；用于基因失活質(zhì)粒：pKD4，pKD46和pCP20，均購(gòu)自耶魯大學(xué)大腸桿菌菌種中心。

1.2 藥品及試劑 阿莫西林 (Amoxicillin，AMO)、頭孢噻呋鈉(Ceftiofur sodium，CF)、頭孢噻肟 (Cefotaxim，CTX)、鹽酸四環(huán)素 (Tetracycline hydrochloride，TET)、多西環(huán)素 (Deoxycycline,DOX)、氟苯尼考(Florfenicol,FLO)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、恩諾沙星 (Enrofloxacin,ENR) 和加替沙星 (Gatifloxacin,GAT)，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；多重耐藥泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β-萘胺(Phenylalanine arginine beta-naphthylamide，PAβN)和羰基氰化物間氯苯腙 (Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)，均購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司 (Sigma-Aldrich)；質(zhì)粒小量提取試劑盒和凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PCR 2×Taq預(yù)混體系和DNA Marker,均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)普洛麥格公司(Promega)；Superscript Ⅲ 反轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)；2×SYBR Green Supermix，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、MH培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；NaCl、Na2HPO4、KCl和KH2PO4，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 低溫離心機(jī)(型號(hào)：7146)、微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(型號(hào)：NanoDrop)，美國(guó)賽默飛世爾科技(Thermo Scientific)；電轉(zhuǎn)儀(型號(hào)：Gene Pulser Xcell)、熒光定量PCR儀(型號(hào)：CFX96)，美國(guó)Bio-Rad公司；梯度基因擴(kuò)增儀(型號(hào)：Biometra Tone 96G)，德國(guó)耶拿公司；生物安全柜(型號(hào)：BHC-1300IIA2)，蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì) 鼠傷寒沙門(mén)菌相關(guān)引物均依據(jù)NCBI公布的SalmonellatyphimuriumLT2 (GenBank登錄號(hào):NC_003197) 基因組序列，利用Primer primer 5軟件設(shè)計(jì)，由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成。試驗(yàn)所用引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

注：下劃線:AcrR表達(dá)用引物攜帶的酶切位點(diǎn)

1.5 基因失活及噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo) 按照黃慧等[13]方法構(gòu)建ST的acrB、ramA、marA和soxS基因失活菌，同源重組打靶DNA片段擴(kuò)增引物和基因失活菌檢測(cè)引物均見(jiàn)表1?；蚴Щ罹?yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司測(cè)序。

通過(guò) P22噬菌體將基因失活菌中失活目的片段按照已報(bào)道的試驗(yàn)方法傳導(dǎo)給臨床菌[14]。(1)制備攜帶基因失活序列的噬菌體。將100 μL的P22噬菌體與10 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的基因失活菌混合，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 h。細(xì)菌裂解后，加入100 μL 氯仿，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20 min。隨后，將菌液6 500 r/min離心20 min，棄去細(xì)胞碎片，吸取上清液以 0.22 μm濾膜過(guò)濾即得攜帶失活基因片段的噬菌體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?2)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)。無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)吸取臨床鼠傷寒沙門(mén)菌過(guò)夜培養(yǎng)物200 μL分別加入到3個(gè)1.5 mL離心管內(nèi)，分別加入1、5 μL和20 μL攜帶失活基因片段的噬菌體，同時(shí)設(shè)置1管不加噬菌體作為空白對(duì)照，1管僅加入20 μL攜帶失活序列的噬菌體作為陰性對(duì)照。將5個(gè)離心管37 ℃靜止20 min，隨后每個(gè)離心管加入LB液體培養(yǎng)基，使其總體積為1 mL。將5個(gè)離心管于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)45 min,菌液6 500 r/min離心5 min 棄上清，用200 μL LB液體培養(yǎng)基懸浮沉淀，分別涂布于含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。(3)陽(yáng)性轉(zhuǎn)導(dǎo)子鑒定。挑取篩選平板的單克隆菌在含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)后，利用基因失活菌檢測(cè)引物 (表1)進(jìn)行PCR檢測(cè)，隨后將陽(yáng)性PCR純化產(chǎn)物送武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司測(cè)序。檢測(cè)不同抗菌藥物對(duì)測(cè)序確證的acrB失活菌、ramA失活菌、marA失活菌和soxS失活菌的MICs。

1.6 MICs檢測(cè) 具體方法按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[15]。挑取待測(cè)菌 (表2) 單克隆，由LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，稀釋菌液使其在MH液體中的濃度為1×105～5×105CFU/mL。將稀釋菌液添加入96孔微量板中，將不同濃度的抗菌藥物溶液進(jìn)行2倍倍比稀釋，放置于37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察結(jié)果以眼觀無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)所在孔的藥物濃度值即為該藥物的MICs。另外，檢測(cè)在多重耐藥泵抑制劑 PAβN(工作濃度，20 mg/L)或CCCP(工作濃度，70 mg/L)存在時(shí)藥物對(duì)ST、CST1、CST2、CST3和CST4的MICs。本試驗(yàn)中每次檢測(cè)均以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，任何2次試驗(yàn)數(shù)值差異均不超過(guò)1個(gè)梯度，試驗(yàn)結(jié)果取3次平均值。

1.7 多重耐藥泵基因表達(dá)水平檢測(cè) 取2 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ST、CST1、CST2、CST3和CST4菌液，按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA。獲得的總RNA經(jīng)DNA酶消化后，使用16S rRNA引物(表1)通過(guò)PCR檢測(cè)總RNA提取物中DNA是否消化完全，并利用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度。

利用Superscript Ⅲ 反轉(zhuǎn)錄酶將1 μg 總RNA按照說(shuō)明書(shū)步驟體外反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，取1 μL cDNA為模板，與熒光定量檢測(cè)引物和2×SYBR Green Supermix 在冰上避光混合，通過(guò)熒光定量PCR儀檢測(cè)cDNA中各基因信使RNA (mRNA) 的Ct值。擴(kuò)增體系(25 μL)：2×SYBR Green Supermix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板 1 μL，超純水 9.5 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性，95 ℃ 30 s;變性，95 ℃ 5 s；退火及延伸,59 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；充分延伸，72 ℃ 10 min;降溫,16 ℃ 30 min。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，最少檢測(cè)3次。所獲Ct值通過(guò) 2-ΔΔCt方法計(jì)算臨床菌所測(cè)基因(表1)相對(duì)ST菌的變化倍數(shù)。

1.8 喹諾酮耐藥決定區(qū)和多重耐藥泵調(diào)控蛋白序列檢測(cè) 以臨床菌CST1、CST2、CST3和CST4菌液為模板，PCR擴(kuò)增其各自喹諾酮耐藥決定區(qū)(gyrA、gyrB、parC和parE)和多重耐藥泵調(diào)控蛋白編碼區(qū)(ramRA、marRA、soxRS和acrR)基因序列。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：2×PCR Mixture 25 μL，上、下游引物各1 μL，菌液1 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性，95 ℃ 3 min;變性，95 ℃ 30 s；退火,30 s (退火溫度：gyrA、gyrB、parC和parE為55 ℃；ramRA、marRA和acrR為53 ℃；soxRS為59 ℃)，共 30個(gè)循環(huán)；充分延伸，72 ℃ 10 min;降溫，16 ℃ 30 min。PCR產(chǎn)物純化后送武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司測(cè)序。

1.9 AcrR表達(dá)載體構(gòu)建及互補(bǔ) 以ST菌液為模板，按1.8方法擴(kuò)增acrR基因序列。隨后，以純化的acrR序列為模板利用引物AR32F和AR32R(表1)擴(kuò)增其開(kāi)放閱讀框。純化后的PCR產(chǎn)物通過(guò)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，其回收產(chǎn)物與同樣雙酶切的pET-32a載體連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子在含有100 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板上篩選。篩選的轉(zhuǎn)化子通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序確定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。最后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入臨床菌CST2、CST3和CST4中并誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)AcrR過(guò)表達(dá)后所測(cè)藥物對(duì)上述細(xì)菌的MICs。

2 結(jié)果

2.1 多重耐藥泵抑制劑對(duì)MICs的影響 多重耐藥泵抑制劑PAβN和CCCP存在時(shí)，不同抗菌藥物對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的MICs見(jiàn)表2。PAβN導(dǎo)致鹽酸四環(huán)素、多西環(huán)素、加替沙星和恩諾沙星對(duì)ST、CST1、CST2、CST3和CST4的MICs下降3.00～26.67倍；氟苯尼考對(duì)CST1和CST2的MICs分別下降3.00倍和5.19倍；環(huán)丙沙星對(duì)CST3的MICs下降6.25倍。另外，CCCP導(dǎo)致氟苯尼考對(duì)ST、CST1和CST2的MICs下降4.67～5.19倍；鹽酸四環(huán)素對(duì)ST、CST1和CST3的MICs下降6.00～13.32倍；多西環(huán)素對(duì)ST和CST1的MICs分別下降8.04倍和3.20倍;但CCCP 沒(méi)有導(dǎo)致所測(cè)藥物對(duì)CST4的MICs發(fā)生明顯改變。

2.2 多重耐藥泵基因相對(duì)表達(dá)水平 臨床菌相對(duì)ST多重耐藥泵基因表達(dá)水平結(jié)果見(jiàn)圖1。4株臨床菌acrA表達(dá)水平相對(duì)ST增加了3～9倍。CST2、CST3和CST4中，多重耐藥泵編碼基因acrF、mdfA和emrB表達(dá)水平也增加5～15倍。但外膜通道蛋白編碼基因tolC僅在CST1和CST4中表達(dá)水平增加3倍以上。mdtK僅在CST2中表達(dá)水平增加3倍以上。

圖1 臨床鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥泵基因相對(duì)表達(dá)水平

2.3 AcrB及其調(diào)控蛋白在藥物敏感性中作用 MICs測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。acrB缺失導(dǎo)致所測(cè)藥物除阿莫西林外對(duì)ST和CST1的MICs下降3.33～80.00倍；所測(cè)藥物除阿莫西林和環(huán)丙沙星外對(duì)CST4的MICs下降3.54～37.66倍；頭孢噻呋鈉、頭孢噻肟、鹽酸四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)CST2和CST3的MICs下降3.00～26.75倍。當(dāng)ramA、marA和soxS基因在細(xì)菌中被分別失活后，所有藥物對(duì)基因失活前后細(xì)菌的MICs變化均沒(méi)有超過(guò)3倍。

表2 鼠傷寒沙門(mén)菌在多重耐藥泵抑制劑、多重耐藥泵AcrB和多重耐藥泵調(diào)控蛋白存在或缺失時(shí)MICs

2.4 喹諾酮耐藥決定區(qū)和多重耐藥泵調(diào)控蛋白靶位點(diǎn)突變 序列檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。4株臨床菌在GyrA均出現(xiàn)Gly133→Glu突變。CST2在ParC出現(xiàn)了Thr57→Ser突變，CST3在GyrA和ParC分別出現(xiàn)了Asp87→Gly和Thr57→Ser突變。另外，CST2、CST3 和CST4的AcrR也發(fā)現(xiàn)了突變。其中，CST2和CST3 的AcrR在第216位氨基酸發(fā)生了突變(Ser→Ala)；CST4中acrR第235位堿基G缺失，導(dǎo)致其在第267位形成TAA終止密碼子，acrR基因轉(zhuǎn)錄提前終止。CST4中acrR基因序列經(jīng)NCBI中BLAST對(duì)比，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)100%同源序列，上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得序列號(hào)為ON614636。另外，AcrAB其他相關(guān)調(diào)控蛋白(RamRA、MarRA和SoxRS) 均未出現(xiàn)突變。

表3 臨床菌喹諾酮耐藥決定區(qū)和多重耐藥泵調(diào)控蛋白AcrR靶位點(diǎn)突變

2.5 AcrR表達(dá)載體構(gòu)建及互補(bǔ) ST菌acrR基因通過(guò)pET-32a載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-acrR，該質(zhì)粒在臨床菌CST2、CST3和CST4中過(guò)表達(dá)后，鹽酸四環(huán)素對(duì)CST2的MICs下降3.00倍，頭孢噻呋鈉、鹽酸四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)CST3的MICs下降3.98～21.40倍；恩諾沙星和加替沙星對(duì)CST4的MICs分別下降4.00倍和3.00倍 (表4)。

表4 臨床菌及其過(guò)表達(dá)AcrR后MICs

3 討論

多重耐藥泵抑制劑PAβN能夠抑制AcrAB和AcrEF表達(dá)，導(dǎo)致多個(gè)藥物對(duì)細(xì)菌的MICs顯著下降[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PAβN導(dǎo)致鹽酸四環(huán)素、多西環(huán)素、恩諾沙星和加替沙星對(duì)ST、CST1、CST2、CST3和CST4的MICs下降3.00～26.67倍;頭孢噻呋鈉和頭孢噻肟MICs沒(méi)有發(fā)生明顯改變。Nikaido等研究顯示，鼠傷寒沙門(mén)菌AcrB能夠外排 β-內(nèi)酰胺類藥物且外排能力與該藥物含有親脂側(cè)鏈的比例有關(guān)[17]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)acrB在ST、CST1、CST2、CST3和CST4中失活后，頭孢噻呋鈉和頭孢噻肟對(duì)所有失活菌的MICs下降3.50～80.00倍。推測(cè)PAβN不能有效增加頭孢噻呋鈉和頭孢噻肟敏感性的原因是這2個(gè)抗菌藥與AcrB結(jié)合能力較強(qiáng)或它們與AcrB結(jié)合位點(diǎn)和PAβN與AcrB結(jié)合位點(diǎn)不同，故PAβN與AcrB結(jié)合后不影響2個(gè)抗菌藥物外排。Lamers等研究發(fā)現(xiàn)，10 mg/L PAβN很難有效增加 β-內(nèi)酰胺類藥物對(duì)銅綠假單胞菌的敏感性，當(dāng)PAβN濃度為25 mg/L 或 50 mg/L時(shí)可顯著增加該類藥物對(duì)銅綠假單胞菌的敏感性，但該增效作用是由于PAβN增加了細(xì)胞膜對(duì) β-內(nèi)酰胺類藥物的通透性而非抑制多重耐藥泵表達(dá)[18]。CCCP是 H+螯合劑，它通過(guò)結(jié)合H+降低細(xì)胞膜兩側(cè)離子濃度差，減少耐藥泵轉(zhuǎn)運(yùn)藥物動(dòng)力從而抑制細(xì)菌多重耐藥。在鼠傷寒沙門(mén)菌體內(nèi)，MATE家族MdtK依賴Na+反向轉(zhuǎn)運(yùn)提供的動(dòng)力將藥物從細(xì)胞內(nèi)排至細(xì)胞質(zhì)間隙[19]。同時(shí)，MFS家族MdfA依賴H+和其他質(zhì)子(Na+或K+)反向轉(zhuǎn)運(yùn)提供的動(dòng)力將藥物從細(xì)胞內(nèi)排至細(xì)胞外，特別是在外排中性藥物(如氯霉素)時(shí)主要依賴Na+或K+反向轉(zhuǎn)運(yùn)提供的動(dòng)力[20]。本試驗(yàn)臨床菌CST2、CST3和CST4中mdfA和CST2中mdtK表達(dá)水平相對(duì)ST顯著增加，這可能是CCCP對(duì)這3株臨床菌抑制作用減弱甚至消除的主要原因。

細(xì)菌對(duì)喹諾酮類的耐藥機(jī)制主要包括喹諾酮耐藥決定區(qū)靶位點(diǎn)突變、活性多重耐藥泵和質(zhì)粒介導(dǎo)。本試驗(yàn)中的臨床鼠傷寒沙門(mén)菌CST2在ParC發(fā)生了Thr57→Ser突變，CST3除上述的ParC突變外，在GyrA還發(fā)生了Asp87→Gly突變，這些突變?cè)谝褕?bào)道的臨床鼠傷寒沙門(mén)菌都曾檢測(cè)到，它們可導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物敏感性降低[21]。另外，4株臨床菌在GyrA都出現(xiàn)了Gly133→Glu突變，該突變?cè)趥抽T(mén)菌中常見(jiàn)，而在鼠傷寒沙門(mén)菌中并不常見(jiàn)[22]。比利時(shí)對(duì)全國(guó)沙門(mén)菌的耐藥性調(diào)研結(jié)果顯示，1 200余株鼠傷寒沙門(mén)菌GyrA攜帶Gly133→Glu突變，該突變不導(dǎo)致鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)喹諾酮類藥物敏感性發(fā)生改變[23]。

AcrR是AcrAB的負(fù)調(diào)控蛋白之一，它以同源二聚體形式與所調(diào)控DNA結(jié)合，抑制基因表達(dá)。鼠傷寒沙門(mén)菌AcrR晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明，每個(gè)AcrR單體由N端的DNA結(jié)合域(Met1-Lys55)和C端的底物結(jié)合域(Ser56-Ala210) 構(gòu)成。其中，C端底物結(jié)合域第4個(gè) α螺旋中的第67位谷氨酸(Glu)與第7個(gè)α螺旋中的第130位甘氨酸(Gln)可形成氫建，該氫鍵對(duì)維持AcrR底物結(jié)合位點(diǎn)的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用。當(dāng)AcrR與底物結(jié)合后，蛋白C端底物結(jié)合域空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其N端的DNA結(jié)合域發(fā)生改變，AcrR從基因序列上解離，受抑制基因的表達(dá)水平增加[24]。對(duì)臨床多重耐藥大腸桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，AcrR突變檢出率要高于MarA和SoxS，其序列與鼠傷寒沙門(mén)菌AcrR序列比較，2個(gè)序列N端209個(gè)氨基酸表現(xiàn)89%同源性，剩余的19個(gè)氨基酸僅有1個(gè)相同[25]。目前在臨床鼠傷寒沙門(mén)菌中AcrR突變很少被發(fā)現(xiàn)，其在多重耐藥鼠傷寒沙門(mén)菌中的作用還不清楚。本試驗(yàn)在臨床鼠傷寒沙門(mén)菌CST2、CST3和CST4中發(fā)現(xiàn)AcrR突變，當(dāng)ST的acrR基因在這3株菌中過(guò)表達(dá)后，鹽酸四環(huán)素對(duì)CST2，頭孢噻呋鈉、鹽酸四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)CST3，恩諾沙星和加替沙星對(duì)CST4的MICs均顯著下降，說(shuō)明AcrR參與了臨床鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥的調(diào)控，該結(jié)論豐富了臨床鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥機(jī)制研究的數(shù)據(jù)。

總之，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AcrB是臨床鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥的主要原因，負(fù)調(diào)控蛋白AcrR突變導(dǎo)致其從acrAB啟動(dòng)子區(qū)解離，acrAB表達(dá)水平增加，細(xì)菌多重耐藥性增強(qiáng)，這可能是臨床鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥的主要分子機(jī)制。