肖麗榮，李 彬，王家偉，成 杰，別鵬飛，史秋梅

(1． 河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，河北 秦皇島 066604；2.秦皇島市撫寧區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局留守營動物防疫監(jiān)督站，河北 撫寧 066301 ; 3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

牛冠狀病毒病是世界范圍內(nèi)的重要牛病，其病原牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起新生犢牛腹瀉和成年牛冬痢、呼吸道疾病最主要的病原體之一，臨床上主要表現(xiàn)為新生犢牛腹瀉、拉血樣糞便、成年牛冬季嚴(yán)重水樣腹瀉(有時伴有血和黏液)等特征，給我國乃至全世界養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。BCoV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組主要編碼5種蛋白，其中N蛋白是BCoV的核衣殼蛋白，具有高度的保守性，常被用于病毒的檢測和鑒定[2-3]。目前，臨床上BCoV疑似病例確診方法主要通過病毒分離鑒定、反轉(zhuǎn)錄PCR和ELISA抗體檢測技術(shù)，且需要在專業(yè)實驗室內(nèi)操作完成，現(xiàn)場應(yīng)用極為不便。

噬菌體展示抗體庫技術(shù)是將外源基因通過基因工程方法插入噬菌體基因組中，外源肽隨噬菌體蛋白的表達(dá)而呈現(xiàn)在噬菌體表面。該技術(shù)自首次闡述以來已經(jīng)發(fā)展成為抗體獲取的強(qiáng)大工具，用于開發(fā)新型藥物、疫苗和診斷試劑等。將抗體庫基因通過隨機(jī)組合拼接后，插入噬菌體外殼蛋白基因中，并融合表達(dá)在噬菌體的表面來特異性淘選獲得特異性單鏈抗體，不僅可以省去繁瑣復(fù)雜的雜交瘤細(xì)胞制備過程，直接從被免疫的動物中獲取基因抗體，節(jié)約時間且特異性強(qiáng)，而且能夠進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[4-5]。

本試驗以重組的BCoV N蛋白為抗原，利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建BCoV N蛋白鼠源噬菌體抗體庫，篩選到具有結(jié)合活性的特異性單鏈抗體，以期用于BCoV新型快速檢測方法的研制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 噬菌粒載體Phagemid、輔助噬菌體M13K07、Pfu DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Mix、DNA Marker、EcoR I和XbaI限制性內(nèi)切酶，均購自TaKaRa公司。BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2021—0006。電穿孔儀GenePulser Xcell，購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 重組N蛋白的表達(dá)與純化 將已構(gòu)建成功的pET28a-N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)菌液至對數(shù)期，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h。取誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎離心，分別取上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE鑒定目的蛋白的表達(dá)情況。將可溶性表達(dá)的N重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化，獲得的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定并測定濃度，用于小鼠免疫和后期抗體篩選。

1.2.2 小鼠免疫及小鼠脾細(xì)胞總RNA提取 將重組的N蛋白免疫BALB/c小鼠，首次免疫使用完全佐劑與抗原(100 μg/只)混合乳化，之后2次使用不完全佐劑與抗原(50 μg/只)混合乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射。首免與二免間隔18 d，二免與三免間隔15 d，免疫3次后第7天小鼠眼球取血，分離血清，摘取脾臟，分離脾臟淋巴細(xì)胞并從中提取總RNA，使用微量紫外可見分光光度計測定RNA質(zhì)量濃度，并用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

1.2.3 抗體可變區(qū)基因重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)的擴(kuò)增及單鏈抗體(scFv)拼接 以小鼠總RNA為模板，按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。按照參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計鼠源抗體VH和VL基因特異性上下游通用引物，并送武漢金開瑞生物工程有限公司合成。取凍存的cDNA為模板，分別擴(kuò)增抗體VH、VL基因，純化回收的VH、VL片段以1∶1混合，通過PCR拼接成scFv基因。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。將拼接的scFv基因按1∶100稀釋作為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的片段scFv。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定并純化回收目的片段。

1.2.4 N蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建 按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取載體，將載體用XbaI和EcoR I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用試劑盒純化回收，將純化的scFv和酶切載體連接，構(gòu)建scFv重組噬菌粒載體。然后將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞[7]，37 ℃作用1 h后取20 μL培養(yǎng)物10倍倍比稀釋，分別取10 μL滴涂在LB/Carb抗性平板37 ℃孵育過夜，計算庫容；剩余菌液則全部轉(zhuǎn)至2L 2YT/Carb/Kan培養(yǎng)基中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)。然后將菌體離心充分沉淀，在上清中加入PEG8000/NaCl，12 000 g離心20 min使噬菌體顆粒沉淀，用PBT重懸沉淀并將噬菌體濃度調(diào)整至1×1013PFU/mL(OD268 nm=2)；按1 mL/管分裝到1.5 mL離心管里，可直接用于噬菌體單鏈抗體庫的淘選，剩余部分凍存于-80 ℃待用。

1.2.5 N蛋白噬菌體單鏈抗體庫的鑒定 在LB/Carb平板上隨機(jī)挑取15個單克隆于LB/Carb液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h后，進(jìn)行菌液PCR鑒定并計算陽性率。

1.2.6 N蛋白噬菌體單鏈抗體庫的富集淘選及特異性單鏈抗體篩選

1.2.6.1 N蛋白噬菌體單鏈抗體庫的富集淘選 以BCoV N蛋白為包被抗原，包被濃度為5 μg/mL，抗原蛋白包被孔和陰性對照孔各4個，每孔100 μL，陰性對照孔只加包被液，4 ℃過夜；加入200 μL封閉液，37 ℃封閉2 h；然后往4個陰性對照孔中各加入100 μL的噬菌體抗體庫，室溫下振蕩孵育1 h；將4個陰性對照孔中的噬菌體抗體庫分別吸取到4個抗原包被孔中，室溫下振蕩孵育2 h；PBST洗10次后，加入100 μL 100 mmol/L HCl，作用5 min，再加入1/8體積的1 mol/L Tris-HCl(pH=11)，混勻，中和洗脫下來的噬菌體溶液；加入10倍體積的對數(shù)生長期的大腸桿菌，1 h后取10 μL進(jìn)行滴度測定，剩余菌液用M13K07侵染擴(kuò)增，第2天純化噬菌體，完成第1輪淘選；共重復(fù)4輪此淘選過程。

1.2.6.2 N蛋白特異性單鏈抗體的篩選 4輪淘選后，隨機(jī)挑取214個克隆，通過間接ELISA篩選陽性克隆株。以碳酸鹽緩沖液包被重組N蛋白，終質(zhì)量濃度為250 ng/mL，37 ℃包被2 h；2%BSA封閉液，37 ℃封閉2 h；以噬菌體克隆培養(yǎng)上清液作為一抗，空載噬菌粒培養(yǎng)上清液作為陰性對照，37 ℃孵育1 h，用PBST洗板5次；以HRP標(biāo)記的anti-M13單克隆抗體作為二抗，5%脫脂奶1∶15 000稀釋，37 ℃孵育1 h；PBST洗板5次；用新配置的TMB顯色液37 ℃避光顯色8 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定OD450 nm值，選取P/N較大的克隆株作為單鏈抗體的陽性克隆株。分別吸取50 μL陽性噬菌體單克隆上清液至1.5 mL EP管中，于沸水中煮10 min，以煮沸的樣品作為PCR的模板，使用scFv的上、下游引物，進(jìn)行噬菌體上清液PCR鑒定，將擴(kuò)增陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.2.6.3 ELISA法檢測噬菌體單鏈抗體結(jié)合活性 以BCoV N蛋白作為包被抗原，陽性噬菌體單鏈抗體上清液從原液開始，分別按 1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000進(jìn)行稀釋，并作為一抗，共做6個梯度，空載噬菌體上清液作為陰性對照，應(yīng)用間接ELISA抗體檢測技術(shù)檢測陽性噬菌體單鏈抗體結(jié)合活性，酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值并分析試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 重組N蛋白的表達(dá)與純化 pET28a-N-BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分別取菌液的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示，重組菌表達(dá)蛋白條帶約在54 kDa處，與預(yù)期大小一致，且表達(dá)產(chǎn)物主要存在于上清中。經(jīng)親和層析純化N蛋白的SDS-PAGE鑒定結(jié)果見圖1，純化后的目的條帶單一，純化效果良好。

圖1 N蛋白的純化分析

2.2 VH、VL基因的擴(kuò)增及scFv拼接 提取小鼠脾臟細(xì)胞總RNA，測定濃度為759 ng/μL。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因VH和VL，擴(kuò)增的VH、VL基因大小均約為400 bp(圖2)；拼接后的scFv基因片段大小約800 bp(圖3)，與預(yù)期大小相符。

圖2 抗體可變區(qū)VH和VL基因的PCR擴(kuò)增

圖3 scFv基因的PCR擴(kuò)增

2.3 N蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及鑒定 將噬菌粒載體純化后用XbaI酶和EcoR I酶進(jìn)行雙酶切鑒定。然后將純化的scFv基因片段和酶切后的載體進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)10倍倍比梯度稀釋滴板，計算抗體庫的庫容為8×108PFU(圖4)。隨機(jī)挑取15個單克隆進(jìn)行PCR鑒定，其中13個克隆可擴(kuò)增出約800 bp大小的目的片段(圖5)，陽性率為86.7%，表明抗體庫構(gòu)建成功。

圖4 庫容測定

圖5 單鏈抗體庫的PCR鑒定

2.4 N蛋白噬菌體單鏈抗體庫的富集淘選及特異性單鏈抗體的篩選 以BCoV N蛋白作為包被抗原包被酶標(biāo)板，經(jīng)過4輪 “孵育—洗脫—擴(kuò)增”淘選，結(jié)果如表1所示，N蛋白特異性噬菌體富集了164.7倍。將第4輪洗液涂板并隨機(jī)挑取214個克隆，經(jīng)間接ELISA抗體檢測技術(shù)篩選針對N蛋白的陽性噬菌體克隆株。為篩選到結(jié)合活性更高的單鏈抗體，選取P/N≥4.5的克隆株作為單鏈抗體的陽性克隆株，用于后期鑒定和應(yīng)用，結(jié)果共篩選獲得32株陽性值較高的噬菌體單鏈抗體(表2)。將這32株陽性噬菌體單鏈抗體進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，32株陽性噬菌體單克隆全部正確擴(kuò)增出約800 bp大小的片段。將PCR擴(kuò)增陽性的產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，其中19株陽性噬菌體單鏈抗體基因序列正確。

表1 噬菌體抗體庫的富集

表2 ELISA篩選針對BCoV N蛋白的特異性噬菌體

2.5 噬菌體單鏈抗體結(jié)合活性的檢測 于19株基因序列正確的陽性噬菌體單鏈抗體中選取陽性值較高的5株陽性噬菌體單鏈抗體，通過間接ELISA檢測其噬菌體抗體結(jié)合活性，其中陽性噬菌體單鏈抗體scFv-154對N蛋白表現(xiàn)出較高的結(jié)合活性(圖6)。

圖6 5株陽性scFv結(jié)合活性的測定

3 討論

傳統(tǒng)的單克隆抗體(Monoclonal antibody，McAb)制備是通過動物免疫、細(xì)胞融合、單克隆細(xì)胞篩選和克隆、單個雜交瘤細(xì)胞群無性繁殖等過程，產(chǎn)生單一、特異性強(qiáng)的抗體。傳統(tǒng)方法可將雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)提取單克隆抗體或通過小鼠腹腔接種制備相應(yīng)的McAb，但生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量均受限制，且細(xì)胞保存條件要求苛刻。1990年，McCafferty等[8]成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于絲狀噬菌體fd基因的下游，使scFv以融合蛋白形式展示于噬菌體表面，該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。

噬菌體抗體庫按基因來源分為免疫抗體庫和天然抗體庫，前者主要來源于免疫動物的淋巴細(xì)胞，其多樣性低，但抗原特異性和結(jié)合能力較強(qiáng)；后者則具有豐富的抗體多樣性，篩選獲得特定抗原結(jié)合力強(qiáng)的抗體較難[9]。與雜交瘤單克隆技術(shù)相比，經(jīng)免疫動物獲得的噬菌體抗體庫技術(shù)，可模擬體內(nèi)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的過程，且不需復(fù)雜的細(xì)胞克隆過程，因此操作簡便、節(jié)省時間。

通常用于評價噬菌體抗體庫質(zhì)量有2個關(guān)鍵指標(biāo)：庫容量和抗體基因的多樣性，其中庫容量大小往往決定高親和力抗體的獲得機(jī)會[10-11]。本試驗以重組的BCoV N蛋白作為免疫原，構(gòu)建了庫容為8×108PFU的鼠源抗BCoV N蛋白噬菌體單鏈抗體庫。當(dāng)免疫庫的庫容達(dá)到106PFU時,即可以保證篩選獲得高親和力的抗體[12]。本試驗結(jié)果顯示，構(gòu)建的抗體庫庫容和抗體多樣性良好，可以滿足一般抗原相關(guān)抗體篩選的要求。

本試驗以牛冠狀病毒重組蛋白N為抗原，通過固相包被抗原4輪淘選方式對抗體庫中特異性噬菌體抗體進(jìn)行富集，獲得了32株與N蛋白特異性結(jié)合的噬菌體克隆株。其中陽性單鏈抗體scFv-154與N蛋白的結(jié)合活性較高，可用于后期鑒定和應(yīng)用。本試驗結(jié)果為牛冠狀病毒N蛋白抗原表位鑒定，建立牛冠狀病毒檢測方法提供科學(xué)依據(jù)。